Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

Die Autoren danken Nora Lakes für das Korrekturlesen. Die in diesem Manuskript berichteten Forschungsergebnisse wurden vom National Heart, Lung, and Blood Institute unter der Award-Nummer R01 HL117952 (E.B.), einem Teil der National Institutes of Health, unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

Patientengewebeproben wurden von den Teilnehmern nach informierter Zustimmung der Sammlung und des Repositorys von Gewebeproben und Daten von Patienten mit Tumoren und Gefäßanomalien im Rahmen eines zugelassenen Institutional Review Board (IRB) gemäß institutional policies am Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute und mit Genehmigung des Committee on Clinical Investigation erhalten. Alle nachstehend beschriebenen Tierverfahren wurden vom CCHMC Institutional Animal C...

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	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

Hier beschreiben wir eine Methode zum Generieren eines vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modells von VM. Dieses murine Modell stellt ein ausgezeichnetes System dar, das es Forschern ermöglicht, ein tieferes Verständnis der pathologischen Lumenvergrößerung zu gewinnen, und wird bei der Entwicklung wirksamerer und zielgerichteterer Therapien für die Behandlung von VM eine wichtige Rolle spielen. Dies kann leicht angepasst werden, um andere Arten von vaskulären Anomalien wie kapillare lymphatische venöse Fehlbildu...

Defekte in der Entwicklung der Vaskulatur sind die zugrunde liegende Ursache für viele Krankheiten, einschließlich venöser Fehlbildung (VM). VM ist eine angeborene Krankheit, die durch abnormale Morphogenese und Ausdehnung derVenen1 gekennzeichnet ist. Wichtige Studien an VM-Gewebe und Endothelzellen (EC) haben Funktionsverstärkungsmutationen in zwei Genen identifiziert: TEK, das den Tyrosinkinase-Rezeptor TIE2 kodiert, und PIK3CA, das die isoform p110(katalytische Subunit) der PI3-Kinase (PI3K)2,3,4,5kodiert. Diese somatischen Mutationen führen zu einer ligaandunabhängigen Hyperaktivierung wichtiger angiogener/wachstumssignaler Wege, einschließlich PI3K/AKT, was zu erweiterten ektatischen Venenführt 3. Trotz dieser wichtigen genetischen Entdeckungen sind die nachfolgenden zellulären und molekularen Mechanismen, die eine abnormale Angiogenese auslösen, und die Bildung vergrößerter Gefäßkanäle noch immer nicht vollständig verstanden.
Während der normalen und pathologischen Angiogenese sprießen neue Gefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz und EC durchlaufen eine Abfolge wichtiger zellulärer Prozesse, einschließlich Proliferation, Migration, extrazelluläre Matrix (ECM) Remodellierung und Lumenbildung6. Zwei- und dreidimensionale (2D/3D) In-vitro-Kulturen der EG sind wichtige Werkzeuge, um jede dieser zellulären Eigenschaften einzeln zu untersuchen. Dennoch besteht die klare Forderung nach einem Mausmodell, das die pathologische Gefäßvergrößerung innerhalb der Wirtsmikroumgebung rekapituliert und gleichzeitig eine effiziente Plattform für die präklinische Bewertung gezielter Medikamente für die translationale Forschung bietet.
Bis heute wurde kein transgenes murines VM-Modell im Zusammenhang mit TIE2-Funktionsverstärkungsmutationen berichtet. Aktuelle transgene VM-Mausmodelle basieren auf der allgegenwärtigen oder gewebebeschränkten Expression der aktivierenden Mutation PIK3CA p.H1047R3,5. Diese transgenen Tiere geben signifikante Einblicke in die ganzkörper- oder gewebespezifischen Wirkungen dieser Hotspot-PIK3CA-Mutation. Die Einschränkung dieser Modelle ist die Bildung eines hochpathologischen Gefäßnetzes, das zu einer frühen Letalität führt. Daher spiegeln diese Mausmodelle das sporadische Auftreten von Mutationsereignissen und die lokalisierte Natur der VM-Pathologie nicht vollständig wider.
Im Gegenteil, patientenabgeleitete Xenograft-Modelle basieren auf der Transplantation oder Injektion von pathologischem Gewebe oder Zellen, die von Patienten in immundefizienten Mäusen abgeleitet wurden7. Xenograft-Modelle sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Wissen über die Krankheitsentwicklung und die Entdeckung neuer therapeutischer Wirkstoffe zu erweitern8. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Patienten-abgeleiteten Zellen Wissenschaftlern, die Heterogenität der Mutation zu rekapitulieren, um das Spektrum der Phänotypen von Patienten zu untersuchen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, in dem patientenabgeleitete VM EC, die eine mutierte konstitutiv-aktive Form von TIE2 und/oder PIK3CA ausdrücken, subkutan in den Rücken athymischer Nacktmäuse injiziert werden. Injizierte Gefäßzellen werden in einem ECM-Rahmen suspendiert, um die Angiogenese zu fördern, wie in früheren vaskulären Xenograft-Modellen9,10,11beschrieben. Diese VM EC durchlaufen eine signifikante Morphogenese und erzeugen vergrößerte, durchfundierte pathologische Gefäße, wenn keine unterstützenden Zellen zur Unterstützung von Zellen zur Welt kommen. Das beschriebene Xenograft-Modell von VM bietet eine effiziente Plattform für die präklinische Bewertung gezielter Medikamente für ihre Fähigkeit, die unkontrollierte Lumenexpansion zu hemmen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

Venöse Fehlbildung (VM) ist eine vaskuläre Anomalie, die durch eine beeinträchtigte Entwicklung des venösen Netzwerks entsteht, was zu erweiterten und oft dysfunktionalen Venen führt. Der Zweck dieses Artikels ist es, sorgfältig die Etablierung eines murinen Xenograft-Modells zu beschreiben, das menschliche VM imitiert und in der Lage ist, die Heterogenität der Patienten widerzuspiegeln. Hyperaktivierende nicht vererbte (somatische) TEK (TIE2) und PIK3CA-Mutationen in Endothelzellen (EC) wurden als Haupttreiber der pathologischen Gefäßvergrößerung in DER VM identifiziert. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung, Reinigung und Erweiterung von patientenabgeleiteten EC-Exzessen mutierten TIE2 und/oder PIK3CA. Diese EC werden subkutan in den Rücken immundefizien athymischer Mäuse injiziert, um ektetische Gefäßkanäle zu erzeugen. Mit TIE2 oder PIK3CA-mutiertem EC erzeugte Läsionen werden innerhalb von 7-u20129 Tagen nach der Injektion sichtbar vaskularisiert und rekapitulieren histopathologische Merkmale des VM-Patientengewebes. Dieses VM-Xenograft-Modell bietet eine zuverlässige Plattform, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die VM-Bildung und -Erweiterung vorantreiben. Darüber hinaus wird dieses Modell für translationale Studien, die die Wirksamkeit neuartiger Wirkstoffkandidaten testen, bei der Verhinderung der abnormalen Gefäßvergrößerung bei menschlichen VMs von entscheidender Bedeutung sein.

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung eines murinen Xenograft-Modells von VM basierend auf der subkutanen Injektion von Patienten-abgeleiteten EC in den Rücken von immundefizienten Nacktmäusen. Endothelzellkolonien können innerhalb von 4 Wochen nach anfänglicher Zellisolierung aus VM-Gewebe oder Lesionalblut geerntet werden (Abbildung 1A,B). Am Tag nach der Injektion bedeckt der Xenograft-Läsionsstopfen eine Fläche von ca. 80-u2012100 mm2. In unseren Händen werden Läsio...

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A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll, um ein murines Xenograft-Modell der venösen Fehlbildung zu erzeugen. Dieses Modell basiert auf der subkutanen Injektion von vom Patienten abgeleiteten Endothelzellen, die hyperaktivierende TIE2- und/oder PIK3CA-Genmutationen enthalten. Xenograft-Läsionen rekapitulieren die histopathologischen Merkmale des VM-Patientengewebes.

Ein vom Patienten abgeleitetes Xenograft-Modell für Venöse Fehlbildungen

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um patientenabgeleitete Xenografts zu erstellen, die die Histopathologie venöser Fehlbildungen rekapitulieren. Dies wurde weiterhin erlaubt, unsere präklinischen therapeutischen Tests durchzuführen. Diese Technik bietet ein schnelles und zuverlässiges NVivo-System, das eine tägliche Überwachung des Wachstums der direkten Endothelzellen des Patienten und die Reaktion auf die experimentelle Therapie ermöglicht.Diese Methode könnte leicht angepasst werden, um andere Arten von vaskulären oder lymphatischen Anomalien zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Zellsuspension für die Injektion. Trypsinisieren Sie die Endothelzellen mit fünf Millilitern vorgewärmt0000 bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten.Neutralisieren Sie die Tripsin und durch Zugabe von fünf Milliliter EGM und sammeln Sie die Zellen in 150 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie es auf 400 mal G für fünf Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter EGM. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Wagen Sie das Volumen mit der gewünschten Zellzahl in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr und pellet die Zellen durch Zentrifugation wieder. Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie ein kleines Volumen zurück, um das Zellpellet zu lösen. Setzen Sie das Zellpellet mit 220 Mikroliter BMEM pro Injektion wieder auf.Mischen Sie die Zellsuspension gründlich auf Eis und stellen Sie sicher, dass Blasen vermieden werden. Die BMEM-Zellkultur in eine ein Milliliter Spritze mischen, indem Sie den Kolben ziehen. Sie verriegeln eine 26 Gauge sterile Nadel an der Spritze und halten die vorbereiteten Spritzen vor der Injektion flach auf Eis.Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Maus richtig anästhesisiert hat, legen Sie sie auf ihren Magen und desinfizieren Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol. Rollen Sie die vorbereitete Spritze vorsichtig, um alle abgesetzten Zellen wieder auszusetzen. Flake Blasen bis zum Ende der Spritze und vertreiben ein kleines Volumen der Zellsuspension.Kneifen Sie die Haut an der Injektionsstelle, um eine Zelt-ähnliche Struktur zu schaffen. Dann setzen Sie die Nadel direkt unter die Haut und stellen Sie sicher, dass die Nadel nur Haut tief ist, indem Sie Pinch Haut, um Injektion in Muskelgewebe zu verhindern. Halten Sie die Nadel kontinuierlich sorgfältig injizieren 200 Mikroliter der Zellsuspension, um eine kleine kugelförmige Masse zu schaffen.Achten Sie darauf, die Zellsuspension nicht in den Muskel zu injizieren. Messen Sie die Länge und Breite jedes Steckers mit einem Bremssattel. Richten Sie die sezierten Xenograft-Stecker auf einem Schneidebrett neben einem Lineal aus und zeichnen Sie ein Bild aus, um die grobe Vaskularität der Läsionen aufzuzeichnen.Dann befestigen Sie die Stecker, indem Sie sie in 10%formalin über Nacht bei Raumtemperatur. Nach der Zerlegung werden die Läsionsstopfen für die histologische Analyse verarbeitet und für UEA-1 gebeizt, um menschliche abgeleitete Endothelzellen innerhalb des Steckers zu erkennen. Nehmen Sie fünf HPF-Bilder pro Läsionsabschnitt mit einem hellen Feldmikroskop bei einer Vergrößerung von 20 X in einem X-Ebenenmuster innerhalb des Läsionsabschnitts auf, um Überlappungen zu vermeiden.Stellen Sie sicher, dass Sie eine Maßstabsleiste auf den aufgenommenen Bildern enthalten. Öffnen Sie die HPF-Bilder im Bild J.To die Pixel der Maßstabsleiste kalibrieren, verwenden Sie das gerade Linienwerkzeug und gehen Sie über die Maßstabsleiste. Konvertieren Sie dann die gemessenen Pixel in Millimeter, indem Sie auf Analysieren und Skalieren festlegen klicken.Klicken Sie dann auf Messen Sie Messungen analysieren und wählen Sie den Bereich aus und fügen Sie sie zur Überlagerung hinzu. Messen Sie die gesamte Feldfläche des HPF mithilfe von Analyse und Messung, indem Sie diese Messung für die Quantifizierung speichern. Mit dem Werkzeug zur Freien Handauswahl skizzieren Sie den UEA-1-positiven Gefäßkanal manuell.Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um den umrissenen Bereich zu quantifizieren. Messen Sie alle Gefäßkanäle innerhalb des HPF. Wiederholen Sie den Vorgang für die fünf HPF, die in jedem Abschnitt aufgenommen wurden, und übertragen Sie die Werte zur weiteren Analyse nach Excel.Berechnen Sie dann den Prozentsatz der Gefäßfläche und Gefäßdichte nach Manuskriptrichtungen. Mit diesem Protokoll werden die Läsionsstopfen mit TIE2 oder PIK3CA hyperaktiven mutierten Endothelzellen sichtbar vaskularisiert und innerhalb von sieben bis neun Tagen nach der Injektion durchsetzt. Die Läsionsstecker ähneln den histopathologischen Merkmalen des menschlichen VM-Gewebes und große Gefäßkanäle, die durch eine dünne Schicht von Endothelzellen ausgerichtet sind, sind sichtbar.Diese Gefäßstrukturen enthalten typischerweise Erythrozyten, die eine funktionelle Anastomose mit der Wirtsmausvaskulatur bestätigen. Immunhistochemische Färbung mit dem menschlichen spezifischen Lektin UEA-1 bestätigt, dass die Zellen, die Gefäßregionen austragen, von menschlichen implantierten Zellen und nicht von Mausvaskulatur abgeleitet werden. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Färbung von Läsionsabschnitten für Marker der Proliferation oder Apoptose durchgeführt werden, um spezifische Auswirkungen von experimentellen Behandlungen zu analysieren.Dieses szenografische Modell wurde für präklinische Studien neuer Therapien zur venösen Fehlbildung verwendet, wie z. B. dem mTOR-Hemmer Rapamycin, der in mehreren klinischen Studien für VM-Patienten Wirksamkeit gezeigt hat.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

Ein Mausmodell Ablenkung Osteogenesis

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...