इस प्रोटोकॉल का उपयोग रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट बनाने के लिए किया जा सकता है जो शिरीन कुरूपता के हिस्टोपैथोलॉजी को पुनः प्राप्त करते हैं। यह आगे हमारे पूर्व नैदानिक चिकित्सकीय परीक्षण ले जाने की अनुमति दी गई थी । यह तकनीक एक तेज और विश्वसनीय एनवीवो प्रणाली प्रदान करती है जो रोगी प्रत्यक्ष एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकास की दैनिक निगरानी और प्रयोगात्मक चिकित्सा की प्रतिक्रिया की अनुमति देती है।
इस विधि को अन्य प्रकार की संवहनी या लसीका विसंगतियों की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इंजेक्शन के लिए सेल निलंबन तैयार करके शुरू करें। दो मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म 0.05% ट्रिपसिन-EDTA के पांच मिलीलीटर के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें।
ट्रिपसिन को बेअसर करें और ईजीएम के पांच मिलीलीटर जोड़कर और कोशिकाओं को 150 मिलीलीटर शंकुवा ट्यूब में एकत्र करें। पांच मिनट के लिए इसे 400 बार जी तक सीमित करें फिर सुपरनेट को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को ईजीएम के तीन मिलीलीटर में फिर से खर्च करें। हीमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
एक नए 50 मिलीलीटर शंकु नली में वांछित सेल नंबर के साथ मात्रा उद्यम और अपकेंद्रित्र द्वारा फिर से कोशिकाओं को गोली। सेल पेलेट को ढीला करने के लिए एक छोटी मात्रा छोड़ने वाले सुपरनेट को एस्पिरेट करें। प्रति इंजेक्शन बीएमईएम के 220 माइक्रोलीटर के साथ सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें।
बुलबुले बनाने से बचने के लिए सुनिश्चित करने के लिए बर्फ पर अच्छी तरह से सेल निलंबन मिश्रण। बीएमईएम सेल संस्कृति को प्लंजर खींचकर एक मिलीलीटर सिरिंज खोलने में मिलाएं। आप सिरिंज के लिए एक 26 गेज बाँझ सुई बंद कर देंगे और इंजेक्शन से पहले बर्फ पर तैयार सिरिंज फ्लैट रखेंगे ।
यह सुनिश्चित करने के बाद कि माउस ने ठीक से एनेस्थेटाइज्ड किया है इसे अपने पेट पर रखें और 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन क्षेत्र को कीटाणुरहित करें। किसी भी बसे कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए तैयार सिरिंज को धीरे से रोल करें। सिरिंज के अंत तक फ्लेक बुलबुले और सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा को निष्कासित।
इंजेक्शन साइट पर त्वचा चुटकी संरचना की तरह एक तंबू बनाने के लिए। फिर त्वचा के नीचे सुई डालें और सुनिश्चित करें कि सुई मांसपेशियों के ऊतकों में इंजेक्शन को रोकने के लिए चुटकी त्वचा जारी करके केवल त्वचा गहरी है। सुई को तेजी से पकड़ना एक छोटा गोलाकार द्रव्यमान बनाने के लिए सेल निलंबन के 200 माइक्रोलीटर को ध्यान से इंजेक्ट करता है।
मांसपेशियों में सेल निलंबन इंजेक्शन से बचने के लिए ध्यान रखना। कैलिपर के साथ प्रत्येक प्लग की लंबाई और चौड़ाई को मापें। एक शासक के बगल में एक काटने बोर्ड पर विच्छेदित ज़ेनोबेड़ा प्लग को संरेखित करें और घावों की सकल संवहनी को रिकॉर्ड करने के लिए एक छवि लें।
फिर कमरे के तापमान पर रात भर में 10% फॉर्मल में उन्हें जलमग्न करके प्लग को ठीक करें। विच्छेदन के बाद, घाव प्लग को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है और प्लग के भीतर मानव व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए यूईए-1 के लिए दाग दिया जाता है। ओवरलैप से बचने के लिए घाव अनुभाग के भीतर एक एक्स विमान पैटर्न में 20 एक्स आवर्धन पर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ प्रति घाव अनुभाग पांच एचपीएफ छवियां लें।
ली गई छवियों पर स्केल बार शामिल करना सुनिश्चित करें। इमेज में एचपीएफ इमेज खोलें J.To स्केल बार के पिक्सल को कैलिब्रेट करें, स्ट्रेट लाइन टूल का इस्तेमाल करें और स्केल बार के ऊपर जाएं । फिर विश्लेषण और सेट स्केल पर क्लिक करके मापा पिक्सेल को मिलीमीटर में परिवर्तित करें।
सेट मापन का विश्लेषण करने और क्षेत्र का चयन करने और ओवरले में जोड़ने पर अगला क्लिक करें। विश्लेषण का उपयोग करके एचपीएफ के कुल क्षेत्र क्षेत्र को मापें और मात्राकरण के लिए इस माप को बचाने के उपाय करें। मुक्त हाथ चयन उपकरण का उपयोग मैन्युअल रूप से UEA-1 सकारात्मक संवहनी चैनल की रूपरेखा।
उल्लिखित क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करने के लिए विश्लेषण और उपाय पर क्लिक करें। एचपीएफ के भीतर सभी संवहनी चैनलों को मापें। प्रत्येक अनुभाग के भीतर लिए गए पांच एचपीएफ के लिए प्रक्रिया को दोहराएं और मूल्यों को आगे के विश्लेषण के लिए एक्सेल में स्थानांतरित करें।
फिर पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार संवहनी क्षेत्र और संवहनी घनत्व के प्रतिशत की गणना करें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके टाई2 या PIK3CA अतिसक्रिय उत्परिवर्ती एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ घाव प्लग इंजेक्शन के बाद सात से नौ दिनों के भीतर संवहनी और perfused दिख रहे हैं । घाव प्लग मानव वीएम ऊतक की हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं के समान होते हैं और एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक पतली परत द्वारा गठबंधन बड़े संवहनी चैनल दिखाई देते हैं।
इन संवहनी संरचनाओं में आम तौर पर एरिथ्रोसाइट्स होते हैं जो मेजबान माउस वैक्यूलेचर के साथ कार्यात्मक एनास्टोमोसिस की पुष्टि करते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल मानव विशिष्ट लेक्टिन यूईए-1 का उपयोग करके धुंधला इस बात की पुष्टि करता है कि संवहनी क्षेत्रों को अस्तर करने वाली कोशिकाएं माउस वेक्यूलेचर के बजाय मानव प्रत्यारोपित कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं। इस प्रक्रिया के बाद, प्रयोगात्मक उपचारों के विशिष्ट प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए प्रसार या एपोप्टोसिस के मार्कर के लिए घाव वर्गों का अतिरिक्त धुंधला किया जा सकता है।
इस स्केनोग्राफिक मॉडल का उपयोग शिर्के कुरूपता के लिए नए उपचारों के पूर्व नैदानिक अध्ययनों के लिए किया गया है, जैसे कि एमटीआर अवरोधक रैपामाइसिन, जिसने वीएम रोगियों के लिए कई नैदानिक परीक्षणों में प्रभावकारिता दिखाई है।