Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

著者らは、ノラ湖の校正に感謝したいと考えています。この原稿で報告された研究は、国立衛生研究所の一部である賞番号R01 HL117952(E.B.)の下で、国立心臓、肺、血液研究所によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

患者組織サンプルは、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)、がんおよび血液疾患研究所の機関政策に基づく承認された機関審査委員会(IRB)の下で、腫瘍および血管異常を有する患者からの組織サンプルおよびデータの収集およびリポジトリからのインフォームド・コンセントに基づいて参加者から得られ、臨床調査委員会の承認を得た。以下に記載されているすべての動物の手順は、CCHM...

<ol>
	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

ここでは、VMの患者由来異種移植片モデルを生成する方法について説明する。このマウスモデルは、研究者が病理学的ルーメンの拡大をより深く理解することを可能にする優れたシステムを提示し、VMの治療のためのより効果的で標的療法の開発に役立ちます。これは、毛細血管リンパ性静脈奇形16のような他のタイプの血管異常を調査するために容易に適応することができ?...

血管系の発達における欠陥は静脈奇形(VM)を含む多くの疾患の根本的な原因である。VMは、静脈の異常な形態形成および拡張を特徴とする先天性疾患である。VM組織および内皮細胞(EC)に関する重要な研究は、チロシンキナーゼ受容体TIE2をコードするTEKとPIK3CAの2つの遺伝子における機能獲得変異を同定2,3,4,した。これらの体細胞変異は、PI3K/AKTを含む主要な血管新生/増殖シグナル伝達経路のリガンド非依存性ハイパー活性化をもたらし、それによって拡張された拡張静脈3をもたらす。これらの重要な遺伝的発見にもかかわらず、異常な血管新生を引き起こすその後の細胞および分子メカニズムと拡大した血管チャネルの形成はまだ完全には理解されていない。
正常および病理学的血管新生の間に、既存の血管ネットワークおよびECから新しい血管が芽生える、増殖、移動、細胞外マトリックス(ECM)リモデリングおよび管腔形成6を含む重要な細胞プロセスの配列を受ける。ECの2次元および3次元(2D/3D)インビトロ培養は、これらの細胞特性を個別に調査するための重要なツールです。それにもかかわらず、宿主微小環境内で病理学的血管の拡大を再現するマウスモデルの需要は明確であり、翻訳研究のための標的薬の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。
最新の状態では、TIE2機能獲得変異に関連するVMのトランスジェニックマウスモデルは報告されていない。現在のトランスジェニックVMマウスモデルは、活性化変異PIK3CA p.H1047R p.H1047R33,55のユビキタスまたは組織制限発現に依存する。これらのトランスジェニック動物は、このホットスポットPIK3CA突然変異の全身または組織特異的な効果に関する重要な洞察を提供する。これらのモデルの限界は、初期致死をもたらす病理学的血管ネットワークの形成である。したがって、これらのマウスモデルは、突然変異事象の散発的な発生およびVM病理の局在的性質を完全に反映していない。
反対に、患者由来の異種移植片モデルは、患者由来の病理組織または細胞を免疫不全マウス7に移植または注入することに基づいている。異種移植片モデルは、疾患の発症と新しい治療薬8の発見に関する知識を広げるための強力なツールです。さらに、患者由来の細胞を使用すると、科学者は突然変異異質性を再現して患者の異型のスペクトルを研究することができます。
ここでは、アチミックヌードマウスの後ろに、TIE2および/またはPIK3CAの変異体を構成的に活性な形態を発現する患者由来VM ECを皮下に注入するプロトコルについて説明する。注入された血管細胞は、以前の血管異種移植片モデル9、10、1110に記載されているように血管新生9を促進するためにECMフレームワークに懸濁される。,11これらのVM ECは、重要な形態形成を受け、支持細胞の不在時に肥大した、浸透した病理学的血管を生成する。VMの記載された異種移植片モデルは、制御不能な内腔の膨張を阻害する能力に対する標的薬物の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

静脈奇形(VM)は、拡張され、しばしば機能不全の静脈をもたらす静脈ネットワークの発達障害から生じる血管異常である。本稿の目的は、ヒトVMを模倣し、患者の異質性を反映することができるマウス異種移植片モデルの確立を慎重に説明することである。内皮細胞(EC)における非遺伝性(体性 )TEK(TIE2) および PIK3CA 突然変異を超活性化することは、VMにおける病理学的血管拡大の主な要因として同定されている。以下のプロトコルは、変異体TIE2および/またはPIK3CAを発現する患者由来ECの分離、精製および拡張について説明する。これらのECは、免疫不全性の高胸腺マウスの後部に皮下に注入され、神経血管チャネルを生成する。TIE2またはPIK3CA変異株ECで発生した病変は、VM患者組織の注射および再構成の7\u20129日以内に目に見えて血管化される。このVM異種移植モデルは、VMの形成と拡張を推進する細胞および分子メカニズムを調査するための信頼性の高いプラットフォームを提供します。また、このモデルは、ヒトVMに見られる異常な血管拡大を防止する新規薬剤候補の有効性をテストする翻訳研究に役立つ。

本プロトコルは、免疫不全ヌードマウスの後部への患者由来ECの皮下注射に基づいてVMのマウス異種移植片モデルを生成するプロセスを説明する。内皮細胞コロニーは、VM組織または病変血液から最初の細胞分離後4週間以内に収穫することができる(図1A、B)。注射の翌日、異種移植病変プラグは約80\u2012100 mm2の表面積をカバーする。私たちの手の中では、TIE2/PIK3CA変異ECを?...

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A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

静脈奇形のマウス異種移植片モデルを生成するための詳細なプロトコルを提示する。このモデルは、超活性化TIE2および/またはPIK3CA遺伝子変異を含む患者由来内皮細胞の皮下注射に基づいている。異種移植病変はVM患者組織の組織病理学的特徴を密接に再現する。

静脈奇形に対する患者由来異種移植片モデル

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

このプロトコルは、静脈奇形の組織病理学を再現する患者由来の異種移植片を作成するために使用することができる。これはさらに、私たちの前臨床治療試験を運ぶことが許されました。この技術は患者直接内皮細胞の成長および実験療法への応答の毎日の監視を可能にする速く、信頼できるNVivoシステムを提供する。この方法は、他のタイプの血管またはリンパ管異常を調査するために容易に適応することができる。まず、細胞懸濁液を注射用に準備します。5ミリリットルのプレ温め 0.05%のトリプイン-EDTAを摂氏37度で2分間トリプシンします。トリップインを中和し、EGMの5ミリリットルを追加し、150ミリリットルの円錐管に細胞を収集します。遠心分離機を5分間Gの400倍にし、上清を吸引し、細胞を3ミリリットルのEGMで再懸濁する。ヘモサイトメーターで細胞を数えます。望ましい細胞数を持つ体積を新しい50ミリリットルの円錐形チューブにベンチャーし、遠心分離によって細胞を再びペレットにします。上清を吸引し、小容量を残して細胞ペレットを緩める。細胞ペレットを1回の注射につきBMEMの220マイクロリットルで再懸濁する。泡を作らないように氷の上に細胞懸濁液を十分に混ぜます。BMEM細胞培養物を吸引し、プランジャーを引っ張って1ミリリットルのシリンジ開口部に混ぜる。26ゲージの無菌針を注射器にロックし、注射前に準備した注射器を氷の上に平らに保ちます。マウスが適切に麻酔をしていることを確認した後、その胃の上に置き、70%エタノールで注射領域を消毒します。準備したシリンジをそっとロールし、落ち着いた細胞を再中断します。フレークは、注射器の端に気泡し、細胞懸濁液の少量を排出します。注射部位で皮膚をつまんで、構造のようなテントを作ります。その後、皮膚のすぐ下に針を挿入し、針が筋肉組織への注入を防ぐためにピンチ皮膚を放出することによって皮膚の深さだけであることを確認します。針を保持し、慎重に慎重に細胞懸濁液の200マイクロリットルを注入し、小さな球状の塊を作成します。細胞の懸濁液を筋肉に注入しないように注意してください。キャリパーで各プラグの長さと幅を測定します。解剖された異種移植片プラグを定規の横のまな板の上に合わせ、画像を撮って病変の総血管を記録します。その後、室温で一晩10%ホルマリンに浸してプラグを固定します。解剖後、病変プラグは組織学的分析のために処理され、UEA-1がプラグ内のヒト由来の内皮細胞を検出するために染色される。重なりを避けるために、病変部内のX面パターンで20 X倍率で明視野顕微鏡で病変部あたり5つのHPF画像を取る。撮影した画像にスケールバーを必ず含めます。画像のHPF画像を開き、スケールバーのピクセルを調整J.To、直線ツールを使用してスケールバーを通過します。次に、[分析]と[スケールを設定]をクリックして、測定されたピクセルをミリメートルに変換します。次に、[セットの計測値を解析]をクリックし、領域を選択してオーバーレイに追加します。分析を使用してHPFの合計フィールド面積を測定し、定量のためにこの測定を保存します。フリーハンド選択ツールを使用して、UEA-1陽性血管チャネルを手動で概説します。[解析と測定] をクリックして、アウトライン領域を数値化します。HPF内のすべての血管チャネルを測定します。各セクション内で取得した 5 つの HPF に対してこのプロセスを繰り返し、さらに分析するために値を Excel に転送します。次に、原稿の方向に従って血管面積と血管密度の割合を計算します。このプロトコルを使用して、TIE2またはPIK3CAの多動性変異体内皮細胞を有する病変プラグは、注射後7〜9日以内に目に見えて血管化され、浸透する。病変プラグは、ヒトVM組織の組織病理学的特徴と、内皮細胞の薄い層によって整列された大きな血管チャネルが見えるのをよく似ている。これらの血管構造は、典型的には、宿主マウス血管系を用いて機能的吻合を確認する赤血球を含む。UEA-1ヒト特異的レクチンを用いた免疫構造染色は、血管領域を裏打ちする細胞がマウス血管構造ではなくヒト移植細胞に由来することを確認する。この手順に従って、増殖またはアポトーシスのマーカーに対する病変セクションの追加染色を行い、実験的治療の特定の効果を分析することができる。このセノミックモデルは、VM患者に対するいくつかの臨床試験で有効性を示しているmTOR阻害剤ラパマイシンのような静脈奇形の新しい治療法の前臨床試験に使用されています。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

発生生物学

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

ヒト多能性のための新しい文化モデルは、プラセンタ馴化培地中のゼラチンの細胞増殖幹

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

マウス胚中足骨の文化：軟骨内骨化の生理学的モデル

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

薬物治療と<em&gt;インビボ</em&gt;メダカ骨粗鬆症モデルにおける骨芽細胞破骨細胞の相互作用のイメージング

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

肺葉切除: 形態学的肝再生手術モデル

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

マウス気晴らし骨形成モデル

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...