Forfatterne vil gjerne takke Nora Lakes for korrekturlesing. Forskning rapportert i dette manuskriptet ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute, under Award Number R01 HL117952 (E.B.), en del av National Institutes of Health. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Pasientvevsprøver ble innhentet fra deltakerne etter informert samtykke fra innsamling og repositorium for vevsprøver og data fra pasienter med svulster og vaskulære anomalier under en godkjent Institutional Review Board (IRB) per institusjonelle retningslinjer ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute og med godkjenning av Committee on Clinical Investigation. Alle dyreprosedyrer beskrevet nedenfor er gjennomgått og godkjent av CCHMC Institutional Animal Care and Us...

<ol>
	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Her beskriver vi en metode for å generere en pasientavledet xenograft modell av VM. Denne murine modellen presenterer et utmerket system som gjør det mulig for forskere å få en dypere forståelse av patologisk lumen utvidelse og vil være medvirkende i å utvikle mer effektive og målrettede terapier for behandling av VM. Dette kan enkelt tilpasses for å undersøke andre typer vaskulære anomalier som kapillær lymfe venøs misdannelse16. Det er flere trinn som er avgjørende for vellykket ge...

Defekter i utviklingen av vaskulaturen er den underliggende årsaken til mange sykdommer, inkludert venøs misdannelse (VM). VM er en medfødt sykdom preget av unormal morfogenese og utvidelse av årer1. Viktige studier på VM vev og endotelceller (EC) har identifisert gain-of-function mutasjoner i to gener: TEK, som koder tyrosin kinase reseptor TIE2, og PIK3CA, som koder p110α (katalytisk underenhet) isoform av PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Disse somatiske mutasjonene resulterer i ligand-uavhengig hyperaktivering av viktige angiogene/vekstsignalveier, inkludert PI3K/AKT, og dermed resulterer i utvidede akomtiske årer3. Til tross for disse viktige genetiske funnene, er de påfølgende cellulære og molekylære mekanismene som utløser unormal angiogenese og dannelsen av forstørrede vaskulære kanaler fortsatt ikke fullt ut forstått.
Under normal og patologisk angiogenese spirer nye fartøy fra et eksisterende vaskulært nettverk og EC en sekvens av viktige cellulære prosesser, inkludert spredning, migrasjon, ekstracellulær matrise (ECM) ombygging oglumenformasjon 6. To- og tredimensjonale (2D/3D) in vitro-kulturer i EC er viktige verktøy for å undersøke hver av disse cellulære egenskapene individuelt. Likevel er det en klar etterspørsel etter en musemodell som rekafulerer patologisk karutvidelse i vertsmikromiljøet, samtidig som det gir en effektiv plattform for preklinisk evaluering av målrettede legemidler for translasjonell forskning.
Oppdatert er det ikke rapportert en transgen murinmodell av VM forbundet med TIE2 gain-of-function mutasjoner. Nåværende transgene VM musemodeller stole på allestedsnærværende eller vev-begrenset uttrykk for aktiverende mutasjon PIK3CA p.H1047R3,5. Disse transgene dyrene gir betydelig innsikt i hele kroppen eller vevsspesifikke effekter av denne hotspot PIK3CA mutasjonen. Begrensningen av disse modellene er dannelsen av et svært patologisk vaskulært nettverk som resulterer i tidlig dødelighet. Dermed reflekterer disse musemodellene ikke fullt ut den sporadiske forekomsten av mutasjonshendelser og lokalisert natur vm-patologi.
Tvert imot er pasientavledede xenograftmodeller basert på transplantasjon eller injeksjon av patologisk vev eller celler avledet fra pasienter til immunsviktelige mus7. Xenograft modeller er et kraftig verktøy for å utvide kunnskap om sykdomsutvikling og oppdagelse av nye terapeutiske midler8. I tillegg, ved hjelp av pasientavledede celler tillater forskere å rekapulere mutasjon heterogenitet for å studere spekteret av pasient fenotyper.
Her beskriver vi en protokoll der pasientavledet VM EC som uttrykker en mutant konstitutivt aktiv form for TIE2 og/eller PIK3CA injiseres subkutant på baksiden av athymiske nakne mus. Injiserte vaskulære celler er suspendert i et ECM rammeverk for å fremme angiogenese som beskrevet i tidligere vaskulære xenograft modeller9,10,11. Disse VM EC gjennomgår betydelig morfogenese og genererer forstørrede, perfused patologiske kar i fravær av støtteceller. Den beskrevne xenograft-modellen av VM gir en effektiv plattform for preklinisk evaluering av målrettede legemidler for deres evne til å hemme ukontrollert lumenutvidelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

Venøs misdannelse (VM) er en vaskulær anomali som oppstår fra nedsatt utvikling av det venøse nettverket som resulterer i utvidede og ofte dysfunksjonelle årer. Formålet med denne artikkelen er å nøye beskrive etableringen av en murine xenograft modell som etterligner menneskelig VM og er i stand til å reflektere pasientens heterogenitet. Hyperaktiverende ikke-arvede (somatiske) TEK (TIE2) og PIK3CA mutasjoner i endotelceller (EC) har blitt identifisert som de viktigste driverne for patologisk karutvidelse i VM. Følgende protokoll beskriver isolasjon, rensing og utvidelse av pasientavledet EF som uttrykker mutert TIE2 og/eller PIK3CA. Disse EC injiseres subkutant på baksiden av immunsviktløse athymiske mus for å generere ekpatiske vaskulære kanaler. Lesjoner generert med TIE2 eller PIK3CA-mutert EC er synlig vaskularisert innen 7\u20129 dager etter injeksjon og rekatoler histopatologiske trekk ved VM pasientvev. Denne VM xenograft modellen gir en pålitelig plattform for å undersøke cellulære og molekylære mekanismer som driver VM dannelse og ekspansjon. I tillegg vil denne modellen være medvirkende for translasjonelle studier som tester effekten av nye legemiddelkandidater for å forhindre unormal fartøyutvidelse sett i menneskelig VM.

Denne protokollen beskriver prosessen med å generere en murine xenograft modell av VM basert på subkutan injeksjon av pasientavledet EC på baksiden av immunsviktløse nakne mus. Endotelcellekolonier kan høstes innen 4 uker etter innledende celleisolasjon fra VM-vev eller lesjonsblod (figur 1A, B). Dagen etter injeksjon dekker xenograftlesjonspluggen et overflateareal på ca. 80\u2012100 mm2. I våre hender er lesjonsplugger med TIE2/PIK3CA-mutert EC synlig vaskularisert og perfundert innen...

Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Vi presenterer en detaljert protokoll for å generere en murine xenograft modell av venøs misdannelse. Denne modellen er basert på subkutan injeksjon av pasientavledede endotelceller som inneholder hyperaktiverende TIE2- og/eller PIK3CA-genmutasjoner. Xenograft lesjoner nøye rekatolere histopatologiske trekk ved VM pasientvev.

En pasientavledet Xenograft-modell for venøs misdannelse

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Denne protokollen kan brukes til å lage pasientavledede xenografter som rekatolerer histopatologien av venøse misdannelser. Dette fikk videre lov til å gjennomføre vår prekliniske terapeutiske testing. Denne teknikken gir et raskt og pålitelig NVivo-system som muliggjør daglig overvåking av veksten av pasientens direkte endotelceller og responsen på eksperimentell terapi.Denne metoden kan lett tilpasses for å undersøke andre typer vaskulære eller lymfatiske anomalier. Begynn med å forberede celleinjeksjonen til injeksjon. Prøv endotelcellene med fem milliliter forhåndsoppvarmede 0,05% turer i EDTA ved 37 grader Celsius i to minutter.Nøytraliser turenein og ved å legge til fem milliliter egm og samle cellene i 150 milliliter konisk rør. Sentrifuge den til 400 ganger G i fem minutter deretter aspirere supernatant og resuspend cellene i tre milliliter av EGM. Tell cellene med et hemocytometer.Venture volumet med ønsket cellenummer inn i en ny 50 milliliter konisk rør og pellet cellene igjen ved sentrifugering. Aspirer det overnaturante og etterlater et lite volum for å løsne cellepelleten. Resuspend cellepellet med 220 mikroliter BMEM per injeksjon.Bland cellesuspensjonen grundig på isen og sørg for å unngå å lage bobler. Aspirer BMEM cellekulturen bland inn i en en en milliliter sprøyteåpning ved å trekke stempelet. Du låser en 26 gauge steril nål til sprøyten og holder de tilberedte sprøytene flate på is før injeksjon.Etter å ha sørget for at musen har riktig bedøvet, legg den på magen og desinfiserer injeksjonsområdet med 70% etanol. Rull forsiktig den tilberedte sprøyten for å bruke eventuelle avgjorte celler på igjen. Flake bobler til enden av sprøyten og utvise et lite volum av celle suspensjon.Klyp huden på injeksjonsstedet for å skape et telt som struktur. Sett deretter nålen rett under huden og sørg for at nålen bare er huden dyp ved å slippe klype hud for å hindre injeksjon i muskelvev. Hold nålen jevnt forsiktig injisere 200 mikroliter av cellesuspensjonen for å skape en liten sfærisk masse.Vær forsiktig for å unngå å injisere cellesuspensjonen i muskelen. Mål lengden og bredden på hver plugg med en kaliper. Juster dissekerte xenograft plugger på et skjærebrett ved siden av en linjal og ta et bilde for å registrere grov vaskularitet av lesjonene.Fest deretter pluggene ved å senke dem ned i 10% formalin over natten ved romtemperatur. Etter disseksjon behandles lesjonspluggene for histologisk analyse og farget for UEA-1 for å oppdage menneskelige avledede endotelceller i pluggen. Ta fem HPF-bilder per lesjonsseksjon med et lyst feltmikroskop ved 20 X forstørrelse i et X-planmønster i lesjonsdelen for å unngå overlapping.Sørg for å inkludere en skaleringslinje på bildene som er tatt. Åpne HPF-bildene i J.To kalibrere pikslene på skalalinjen, bruk det rette linjeverktøyet og gå over skalalinjen. Konverter deretter de målte pikslene til millimeter ved å klikke på Analyser og angi skala.Neste klikk på Analyser settmålinger og velg område og legg til i overlegg. Mål det totale feltområdet i HPF ved hjelp av analyser og målbesparing av denne målingen for kvantifisering. Bruk verktøyet for frihåndsvalg manuelt skissere UEA-1 positiv vaskulær kanal.Klikk på Analyser og mål for å kvantifisere det skisserte området. Mål alle vaskulære kanaler i HPF. Gjenta prosessen for de fem HPF-ene som er tatt i hver del, og overfør verdiene til Excel for videre analyse.Beregn deretter prosentandelen vaskulært område og vaskulær tetthet i henhold til manuskriptretninger. Ved hjelp av denne protokollen plugges lesjonen med TIE2 eller PIK3CA hyperaktive muterte endotelceller synlig vaskularisert og perfunderes innen syv til ni dager etter injeksjon. Lesjonspluggene ligner på histopatologiske trekk ved menneskelig VM-vev og store vaskulære kanaler justert av et tynt lag av endotelceller er synlige.Disse vaskulære strukturer inneholder vanligvis erytrocytter som bekrefter funksjonell anastomose med vertsmusvasulaturen. Immunohistokjemisk farging ved hjelp av den menneskelige spesifikke lectin UEA-1 bekrefter at cellene fôr vaskulære regioner er avledet fra menneskelige implanterte celler i stedet for musevaskulatur. Etter denne prosedyren kan ytterligere farging av lesjonsseksjoner for markører for spredning eller apoptose utføres for å analysere spesifikke effekter av eksperimentelle behandlinger.Denne scenografiske modellen har blitt brukt til prekliniske studier av nye behandlinger for venøs misdannelse, som mTOR-hemmeren rapamycin, som har vist effekt i flere kliniske studier for VM-pasienter.

a-patient-derived-xenograft-model-for-venous-malformation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.2K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. This protocol can be used to create patient-derived xenografts that recapitulate the histopathology of venous malformations. This was further allowed to carry our preclinical therapeutic testing. This technique provides a fast and reliable NVivo system that allows daily monitoring of the growth of patient direct endothelial cells and the response to experimental therapy.This method could be easily adapted to investigate other types of vascular or lymphatic anomalies. Begin by preparing...