Denne protokollen kan brukes til å lage pasientavledede xenografter som rekatolerer histopatologien av venøse misdannelser. Dette fikk videre lov til å gjennomføre vår prekliniske terapeutiske testing. Denne teknikken gir et raskt og pålitelig NVivo-system som muliggjør daglig overvåking av veksten av pasientens direkte endotelceller og responsen på eksperimentell terapi.
Denne metoden kan lett tilpasses for å undersøke andre typer vaskulære eller lymfatiske anomalier. Begynn med å forberede celleinjeksjonen til injeksjon. Prøv endotelcellene med fem milliliter forhåndsoppvarmede 0,05% turer i EDTA ved 37 grader Celsius i to minutter.
Nøytraliser turenein og ved å legge til fem milliliter egm og samle cellene i 150 milliliter konisk rør. Sentrifuge den til 400 ganger G i fem minutter deretter aspirere supernatant og resuspend cellene i tre milliliter av EGM. Tell cellene med et hemocytometer.
Venture volumet med ønsket cellenummer inn i en ny 50 milliliter konisk rør og pellet cellene igjen ved sentrifugering. Aspirer det overnaturante og etterlater et lite volum for å løsne cellepelleten. Resuspend cellepellet med 220 mikroliter BMEM per injeksjon.
Bland cellesuspensjonen grundig på isen og sørg for å unngå å lage bobler. Aspirer BMEM cellekulturen bland inn i en en en milliliter sprøyteåpning ved å trekke stempelet. Du låser en 26 gauge steril nål til sprøyten og holder de tilberedte sprøytene flate på is før injeksjon.
Etter å ha sørget for at musen har riktig bedøvet, legg den på magen og desinfiserer injeksjonsområdet med 70% etanol. Rull forsiktig den tilberedte sprøyten for å bruke eventuelle avgjorte celler på igjen. Flake bobler til enden av sprøyten og utvise et lite volum av celle suspensjon.
Klyp huden på injeksjonsstedet for å skape et telt som struktur. Sett deretter nålen rett under huden og sørg for at nålen bare er huden dyp ved å slippe klype hud for å hindre injeksjon i muskelvev. Hold nålen jevnt forsiktig injisere 200 mikroliter av cellesuspensjonen for å skape en liten sfærisk masse.
Vær forsiktig for å unngå å injisere cellesuspensjonen i muskelen. Mål lengden og bredden på hver plugg med en kaliper. Juster dissekerte xenograft plugger på et skjærebrett ved siden av en linjal og ta et bilde for å registrere grov vaskularitet av lesjonene.
Fest deretter pluggene ved å senke dem ned i 10% formalin over natten ved romtemperatur. Etter disseksjon behandles lesjonspluggene for histologisk analyse og farget for UEA-1 for å oppdage menneskelige avledede endotelceller i pluggen. Ta fem HPF-bilder per lesjonsseksjon med et lyst feltmikroskop ved 20 X forstørrelse i et X-planmønster i lesjonsdelen for å unngå overlapping.
Sørg for å inkludere en skaleringslinje på bildene som er tatt. Åpne HPF-bildene i J.To kalibrere pikslene på skalalinjen, bruk det rette linjeverktøyet og gå over skalalinjen. Konverter deretter de målte pikslene til millimeter ved å klikke på Analyser og angi skala.
Neste klikk på Analyser settmålinger og velg område og legg til i overlegg. Mål det totale feltområdet i HPF ved hjelp av analyser og målbesparing av denne målingen for kvantifisering. Bruk verktøyet for frihåndsvalg manuelt skissere UEA-1 positiv vaskulær kanal.
Klikk på Analyser og mål for å kvantifisere det skisserte området. Mål alle vaskulære kanaler i HPF. Gjenta prosessen for de fem HPF-ene som er tatt i hver del, og overfør verdiene til Excel for videre analyse.
Beregn deretter prosentandelen vaskulært område og vaskulær tetthet i henhold til manuskriptretninger. Ved hjelp av denne protokollen plugges lesjonen med TIE2 eller PIK3CA hyperaktive muterte endotelceller synlig vaskularisert og perfunderes innen syv til ni dager etter injeksjon. Lesjonspluggene ligner på histopatologiske trekk ved menneskelig VM-vev og store vaskulære kanaler justert av et tynt lag av endotelceller er synlige.
Disse vaskulære strukturer inneholder vanligvis erytrocytter som bekrefter funksjonell anastomose med vertsmusvasulaturen. Immunohistokjemisk farging ved hjelp av den menneskelige spesifikke lectin UEA-1 bekrefter at cellene fôr vaskulære regioner er avledet fra menneskelige implanterte celler i stedet for musevaskulatur. Etter denne prosedyren kan ytterligere farging av lesjonsseksjoner for markører for spredning eller apoptose utføres for å analysere spesifikke effekter av eksperimentelle behandlinger.
Denne scenografiske modellen har blitt brukt til prekliniske studier av nye behandlinger for venøs misdannelse, som mTOR-hemmeren rapamycin, som har vist effekt i flere kliniske studier for VM-pasienter.
