Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a Nora Lakes pela revisão. A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute, sob o Prêmio Número R01 HL117952 (E.B.), parte dos Institutos Nacionais de Saúde. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Amostras de tecido de pacientes foram obtidas dos participantes após o consentimento informado do Collection and Repositório de Amostras de Tecidos e Dados de Pacientes com Tumores e Anomalias Vasculares sob um Conselho de Revisão Institucional (IRB) aprovado por políticas institucionais no Centro Médico hospitalar infantil de Cincinnati (CCHMC), Instituto de Câncer e Doenças sanguíneas e com aprovação do Comitê de Investigação Clínica. Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram revisados e aprov...

<ol>
	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

Aqui, descrevemos um método para gerar um modelo de xenoenxerto derivado do paciente de VM. Este modelo murino apresenta um excelente sistema que permite aos pesquisadores obter uma compreensão mais profunda do alargamento patológico do lúmen e será fundamental no desenvolvimento de terapias mais eficazes e direcionadas para o tratamento de VM. Isso pode ser facilmente adaptado para investigar outros tipos de anomalias vasculares, como a malformação venosa linfática capilar16. Existem vár...

Defeitos no desenvolvimento da vasculatura são a causa básica de muitas doenças, incluindo a malformação venosa (VM). VM é uma doença congênita caracterizada por morfogênese anormal e expansão das veias1. Estudos importantes sobre tecido VM e células endoteliais (CE) identificaram mutações de ganho de função em dois genes: TEK, que codifica o receptor de quinase tiesina TIE2, e PIK3CA, que codifica o isóforme p110α (subunidade catalítica) de PI3-kinase (PI3K)2,3,,4,5. Essas mutações somáticas resultam em hiperativação independente de ligante das principais vias de sinalização angiogênica/de crescimento, incluindo PI3K/AKT, resultando assim em veias ectáticas dilatadas3. Apesar dessas importantes descobertas genéticas, os mecanismos celulares e moleculares subsequentes que desencadeiam angiogênese anormal e a formação de canais vasculares ampliados ainda não são totalmente compreendidos.
Durante a angiogênese normal e patológica, novos vasos brotam de uma rede vascular pré-existente e a CE passa por uma sequência de processos celulares importantes, incluindo proliferação, migração, remodelação de matriz extracelular (ECM) e formação de lúmen6. Culturas in vitro in vitro de duas e tridimensionais (2D/3D) da CE são ferramentas importantes para investigar cada uma dessas propriedades celulares individualmente. No entanto, há uma clara demanda por um modelo de mouse recapitulando o alargamento de vasos patológicos dentro do microambiente hospedeiro, ao mesmo tempo em que fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para pesquisa translacional.
Até o momento, não foi relatado um modelo de murina transgênica de VM associado às mutações de ganho de função TIE2. Os modelos atuais de camundongos VM transgênicos dependem da expressão onipresente ou restrita ao tecido da mutação ativante PIK3CA p.H1047R3,5. Esses animais transgênicos fornecem uma visão significativa sobre efeitos específicos do corpo inteiro ou tecido desta mutação PIK3CA hotspot. A limitação desses modelos é a formação de uma rede vascular altamente patológica resultando em letalidade precoce. Assim, esses modelos de camundongos não refletem totalmente a ocorrência esporádica de eventos mutacionais e a natureza localizada da patologia VM.
Pelo contrário, os modelos de xenoenxerto derivados do paciente baseiam-se no transplante ou injeção de tecido patológico ou células derivadas de pacientes em camundongos imunodeficientes7. Os modelos de xenoenxerto são uma poderosa ferramenta para ampliar o conhecimento sobre o desenvolvimento de doenças e a descoberta de novos agentes terapêuticos8. Além disso, o uso de células derivadas do paciente permite que os cientistas recapitulem a heterogeneidade da mutação para estudar o espectro de fenótipos do paciente.
Aqui, descrevemos um protocolo onde vm ec derivados do paciente que expressam uma forma mutante constitutivamente ativa de TIE2 e/ou PIK3CA são injetados subcutâneamente na parte de trás de ratos nus atímicos. As células vasculares injetadas estão suspensas em uma estrutura de ECM, a fim de promover a angiogênese, conforme descrito nos modelos anteriores de xenoenxerto vascular9,,10,,11. Estes VM EC sofrem morfogênese significativa e geram vasos patológicos ampliados e perfundidos na ausência de células de suporte. O modelo de xenoenxerto descrito de VM fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para sua capacidade de inibir a expansão de lúmen descontrolada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

A malformação venosa (VM) é uma anomalia vascular que surge do desenvolvimento prejudicado da rede venosa resultando em veias dilatadas e muitas vezes disfuncionais. O objetivo deste artigo é descrever cuidadosamente o estabelecimento de um modelo de xenoenxerto murina que imita vm humano e é capaz de refletir a heterogeneidade do paciente. Mutações não herdadas (somáticas) TEK (TIE2) e PIK3CA hiperativas em células endoteliais (CE) foram identificadas como os principais condutores do alargamento de vasos patológicos em VM. O protocolo a seguir descreve o isolamento, purificação e expansão da CE derivada do paciente expressando tie2 mutante e/ou PIK3CA. Estes CE são injetados subcutâneamente na parte de trás de camundongos atímicos imunodeficientes para gerar canais vasculares ectáticos. As lesões geradas com TIE2 ou PIK3CA-mutante EC são visivelmente vascularizadas dentro de 7\u20129 dias após a injeção e recapitulam características histopatológicas do tecido do paciente VM. Este modelo de xenergrafto VM fornece uma plataforma confiável para investigar os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a formação e expansão de VM. Além disso, este modelo será fundamental para estudos translacionais que testam a eficácia de novos candidatos a medicamentos na prevenção do alargamento anormal de vasos vistos em VM humano.

Este protocolo descreve o processo de geração de um modelo de xenoenxerto de murina de VM baseado na injeção subcutânea de CE derivada do paciente na parte de trás de camundongos nus imunodeficientes. Colônias de células endoteliais podem ser colhidas dentro de 4 semanas após o isolamento celular inicial do tecido VM ou sangue lesão(Figura 1A,B). No dia seguinte à injeção, o plugue da lesão de xenoenxerto cobre uma área de superfície de aproximadamente 80\u2012100 mm2. Em nossa...

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A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Apresentamos um protocolo detalhado para gerar um modelo de xenoenxerto murine de malformação venosa. Este modelo é baseado na injeção subcutânea de células endoteliais derivadas do paciente contendo mutações genéticas TIE2 e/ou PIK3CA hiperativantes. As lesões de xenoenxerto recapitulam de perto as características histopatológicas do tecido do paciente VM.

Um modelo de xenoenxerto derivado do paciente para malformação venosa

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Este protocolo pode ser usado para criar xenoenxertos derivados do paciente que recapitulam a histopatologia de malformações venosas. Isso foi ainda permitido para realizar nossos testes terapêuticos pré-clínicos. Esta técnica fornece um sistema NVivo rápido e confiável que permite o monitoramento diário do crescimento das células endoteliais diretas do paciente e a resposta à terapia experimental.Este método poderia ser facilmente adaptado para investigar outros tipos de anomalias vasculares ou linfáticas. Comece preparando a suspensão celular para injeção. Trypsinize as células endoteliais com cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA a 37 graus Celsius por dois minutos.Neutralize a tripsina e adicionando cinco mililitros de EGM e colete as células em tubo cônico de 150 mililitros. Centrifuá-lo a 400 vezes G por cinco minutos, em seguida, aspirar o supernaspe e resuspensar as células em três mililitros de EGM. Conte as células com um hemócito.Aventure o volume com o número celular desejado em um novo tubo cônico de 50 mililitros e pelota as células novamente por centrifugação. Aspire o supernasce deixando um pequeno volume para soltar a pelota celular. Resuspend a pelota celular com 220 microliters de BMEM por injeção.Misture bem a suspensão celular no gelo, certificando-se de evitar a criação de bolhas. Aspire a cultura celular BMEM em uma abertura de seringa de um mililitro puxando o êmbolo. Você vai travar uma agulha estéril calibre 26 na seringa e manter as seringas preparadas planas no gelo antes da injeção.Depois de garantir que o rato tenha anestesiado corretamente coloque-o em seu estômago e desinfete a região de injeção com 70% de etanol. Role suavemente a seringa preparada para resususpensar quaisquer células assentadas. Bolhas de flocos até o fim da seringa e expulsam um pequeno volume da suspensão celular.Aperte a pele no local da injeção para criar uma tenda como estrutura. Em seguida, insira a agulha bem debaixo da pele e certifique-se de que a agulha é apenas profunda da pele liberando a pele de beliscão para evitar a injeção no tecido muscular. Segurando a agulha injete cuidadosamente 200 microliters da suspensão celular para criar uma pequena massa esférica.Tome cuidado para evitar injetar a suspensão celular no músculo. Meça o comprimento e a largura de cada plugue com uma pinça. Alinhe os plugues de xenoenxerto dissecados em uma placa de corte ao lado de uma régua e tire uma imagem para registrar a vascularização bruta das lesões.Em seguida, fixar os plugues submergindo-os em 10% de formalina durante a noite à temperatura ambiente. Após a dissecção, os plugues da lesão são processados para análise histológica e manchados para a UEA-1 detectar células endoteliais derivadas humanas dentro do plugue. Pegue cinco imagens de HPF por seção de lesão com um microscópio de campo brilhante a 20 X de ampliação em um padrão de plano X dentro da seção de lesão para evitar sobreposição.Certifique-se de incluir uma barra de escala nas imagens tiradas. Abra as imagens do HPF na imagem J.To calibrar os pixels da barra de escala, usar a ferramenta em linha reta e passar por cima da barra de escala. Em seguida, converta os pixels medidos em milímetros clicando em Analisar e Definir escala.Clique em Analisar medidas de conjunto e selecione área e adicione à sobreposição. Meça a área total de campo do HPF utilizando analisar e medir a economia desta medição para quantificação. Utilizando a ferramenta de seleções manuais gratuitas delineia manualmente o canal vascular positivo UEA-1.Clique em Analisar e Medir para quantificar a área delineada. Meça todos os canais vasculares dentro do HPF. Repita o processo para os cinco HPF tomados dentro de cada seção e transfira os valores para o Excel para análise posterior.Em seguida, calcule a porcentagem de área vascular e densidade vascular de acordo com as instruções do manuscrito. Usando este protocolo, os plugues de lesão com células endoteliais hiperativas TIE2 ou PIK3CA são visivelmente vascularizadas e perfundidas dentro de sete a nove dias após a injeção. Os plugues de lesão se assemelham muito às características histopatológicas do tecido VM humano e grandes canais vasculares alinhados por uma fina camada de células endoteliais são visíveis.Essas estruturas vasculares normalmente contêm eritrócitos confirmando anastomose funcional com a vasculatura do rato hospedeiro. A coloração imunohistoquímica usando a lectina específica humana UEA-1 confirma que as células que revestem regiões vasculares são derivadas de células implantadas humanas em vez da vasculatura do rato. Após este procedimento, pode ser realizada uma coloração adicional de seções de lesões para marcadores de proliferação ou apoptose para analisar efeitos específicos de tratamentos experimentais.Este modelo cenográfico tem sido usado para estudos pré-clínicos de novas terapias para malformação venosa, como o inibidor mTOR rapamicina, que tem mostrado eficácia em vários ensaios clínicos para pacientes com VM.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Biologia do Desenvolvimento

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

Um modelo de osteogênese de distração do rato

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...