Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

Författarna vill tacka Nora Lakes för korrekturläsning. Forskning som rapporterats i detta manuskript stöddes av National Heart, Lung, och Blood Institute, under Award Number R01 HL117952 (E.B.), en del av National Institutes of Health. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

Patient vävnadsprover erhölls från deltagarna efter informerat samtycke från insamling och förråd av vävnadsprover och data från patienter med tumörer och vaskulära anomalier under en godkänd institutionell granskningsnämnd (IRB) per institutionell politik vid Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute och med godkännande av kommittén för klinisk undersökning. Alla djurprocedurer som beskrivs nedan har granskats och godkänts av CCHMC Institutional Animal Car...

<ol>
	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

Här beskriver vi en metod för att generera en patient-härledda xenograft modell av VM. Denna murine modell presenterar ett utmärkt system som gör det möjligt för forskare att få en djupare förståelse för patologiska lumen utvidgningen och kommer att vara avgörande för att utveckla effektivare och riktade terapier för behandling av VM. Detta kan enkelt anpassas för att undersöka andra typer av vaskulära anomalier såsom kapillärlymfatisk venös missbildning16. Det finns flera steg...

Defekter i utvecklingen av vasculature är den bakomliggande orsaken till många sjukdomar inklusive venous missbildning (VM). VM är en medfödd sjukdom som kännetecknas av onormal morfogenes och expansion av vener1. Viktiga studier på VM-vävnad och endotelceller (EC) har identifierat gain-of-function mutationer i två gener: TEK, som kodar tyrosinkinasreceptorn TIE2, och PIK3CA, som kodar p110α (katalytisk subenhet) isoform av PI3-kinas (PI3K)2,3,4,5. Dessa somatiska mutationer resulterar i ligand-oberoende hyperaktivering av viktiga angiogena/tillväxtsignaleringsvägar, inklusive PI3K/AKT, och resulterar därigenom i dilaterade ektatiska vener3. Trots dessa viktiga genetiska upptäckter, de efterföljande cellulära och molekylära mekanismerna utlöser onormal angiogenes och bildandet av utvidgade Vaskulär kanaler är fortfarande inte helt klarlagda.
Under normal och patologisk angiogenes, nya fartyg gro från en redan existerande vaskulär nätverk och EG genomgår en sekvens av viktiga cellulära processer inklusive spridning, migration, extracellulär matris (ECM) ombyggnad och lumenbildning6. Två- och tredimensionella (2D/3D) in vitro kulturer av EG är viktiga verktyg för att undersöka var och en av dessa cellulära egenskaper individuellt. Trots detta finns det en tydlig efterfrågan på en musmodell som rekapitulerar patologiska fartygsförstoring inom värdmikromiljöen samtidigt som den utgör en effektiv plattform för preklinisk utvärdering av riktade läkemedel för translationell forskning.
Upp till datum, en transgenic murine modell av VM är associerad med TIE2 gain-of-function mutationer har inte rapporterats. Nuvarande transgena VM musmodeller förlitar sig på det allestädes närvarande eller vävnadsbegränsade uttrycket för den aktiverande mutationen PIK3CA p.H1047R3,5. Dessa transgena djur ger betydande insikt i hela kroppen eller vävnadsspecifika effekter av denna hotspot PIK3CA mutation. Begränsningen av dessa modeller är bildandet av ett mycket patologiskt vaskulärt nätverk som resulterar i tidig dödlighet. Således återspeglar dessa musmodeller inte helt den sporadiska förekomsten av mutationella händelser och lokaliserad karaktär VM patologi.
Tvärtom är modeller med patienthärledd xenograft baserad på transplantation eller injektion av patologisk vävnad eller celler som härrör från patienter till immunficienta möss7. Xenograft modeller är ett kraftfullt verktyg för att bredda kunskapen om sjukdomsutveckling och upptäckt av nya terapeutiska medel8. Dessutom, med hjälp av patient-härledda celler tillåter forskare att rekapitulera mutation heterogenitet att studera spektrumet av patientens fenotyper.
Här beskriver vi ett protokoll där patient-härledda VM EG som uttrycker en mutant konstitutivt-aktiv form av TIE2 och/eller PIK3CA injiceras subkutant i baksidan av athymic naken möss. Injicerade vaskulära celler är upphängda i en ECM-ram för att främja angiogenes enligt beskrivningen i tidigare vaskulära xenograft-modeller9,10,11. Dessa VM EG genomgå betydande morfogenes och generera utvidgade, perfused patologiska fartyg i avsaknad av stödjande celler. Den beskrivna xenograft-modellen av virtuell dator ger en effektiv plattform för preklinisk utvärdering av riktade läkemedel för deras förmåga att hämma okontrollerad lumen expansion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

Venous missbildning (VM) är en Vaskulär anomali som uppstår från nedsatt utveckling av det venous nätverket som resulterar i dilaterad och ofta dysfunktionella vener. Syftet med denna artikel är att noggrant beskriva inrättandet av en murine xenograft modell som härmar mänskliga VM och är kunna återspegla patientens heterogenitet. Hyper-aktiverande icke-ärvda (somatiska) TEK (TIE2) och PIK3CA mutationer i endotelceller (EG) har identifierats som de viktigaste drivkrafterna för patologiska fartyg utvidgningen i VM. Följande protokoll beskriver isolering, rening och utvidgning av patient-härledda EG uttrycker mutant TIE2 och/eller PIK3CA. Dessa EG injiceras subkutant i baksidan av immunodeficient athymic möss att generera ectatic Vaskulära kanaler. Skador som genereras med TIE2 eller PIK3CA-mutant EG är synligt vascularized inom 7\u20129 dagar efter injektion och rekapitulera histopatologiska funktioner av VM patient vävnad. Denna VM xenograft modell ger en tillförlitlig plattform för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som driver VM-formation och expansion. Dessutom kommer denna modell att vara avgörande för translationella studier testa effekten av nya läkemedelskandidater för att förhindra den onormala kärl utvidgningen ses i mänskliga VM.

Detta protokoll beskriver processen för att generera en murine xenograft modell av VM baserat på subkutan injektion av patient-härledda EG i baksidan av immundeficient naken möss. Endotelcellskolonier kan skördas inom 4 veckor efter den inledande cellisolering från VM-vävnad eller lesionalt blod (Figur 1A,B). Dagen efter injektionen täcker xenograft-lesionspluggen en yta på ungefär 80\u2012100 mm2. I våra händer, lesion pluggar med TIE2/PIK3CA-mutant EG är synligt vascularized och...

Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Vi presenterar ett detaljerat protokoll för att generera en murine xenograft modell av venous missbildning. Denna modell är baserad på subkutan injektion av patient-härledda endotelceller som innehåller hyper-aktiverande TIE2 och/eller PIK3CA genmutationer. Xenograft skador recapitulate nära de histopatologiska funktionerna i VM patient vävnad.

En patient-derived Xenograft modell för Venous Missformation

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Detta protokoll kan användas för att skapa patient-härledda xenografts som rekapitulate histopatologi av venous missbildningar. Detta var ytterligare tillåtet att bära vår prekliniska terapeutiska tester. Denna teknik ger ett snabbt och tillförlitligt NVivo-system som möjliggör daglig övervakning av tillväxten av patientens direkta endotelceller och svaret på experimentell terapi.Denna metod skulle lätt kunna anpassas för att undersöka andra typer av vaskulära eller lymfatiska anomalier. Börja med att förbereda cellen suspension för injektion. Trypsinize de endotelceller med fem milliliter förvuppvade 0,05%tripsin-EDTA vid 37 grader Celsius i två minuter.Neutralisera tripsin och genom att lägga till fem milliliter extra bolagsstämma och samla in cellerna i 150 milliliter koniskt rör. Centrifugera det till 400 tider G för fem noterar därefter aspirera supernatanten och resuspend cellerna i tre milliliters av EGM. Räkna cellerna med en hemocytometer.Venture volymen med önskad cell nummer i en ny 50 milliliter koniska rör och pellet cellerna igen genom centrifugeringen. Aspirera supernatanten som lämnar en liten volym för att lossa cellpelleten. Resuspend cell pelleten med 220 mikroliter bmem per injektion.Blanda cellen suspensionen ordentligt på is se till att undvika att skapa bubblor. Aspirera BMEM-cellkulturen blandas i en en milliliter spruta öppning genom att dra kolven. Du låser en 26 gauge steril nål till sprutan och hålla de förberedda sprutorna platt på is före injektionen.Efter att ha säkerställt att musen har ordentligt sövd placera den på magen och desinficera injektionsregionen med 70%etanol. Rulla försiktigt den förberedda sprutan för att återanvända eventuella avgjorda celler. Flake bubblor till slutet av sprutan och utvisa en liten volym av cellen suspension.Nyp ihop huden vid injektionsstället för att skapa ett tält som struktur. Sätt sedan in nålen rakt under huden och se till att nålen bara är hud djupt genom att släppa nypa huden för att förhindra injektion i muskelvävnad. Hålla nålen stadigt försiktigt injicera 200 mikroliter av cellen suspensionen för att skapa en liten sfärisk massa.Var noga med att undvika att injicera cellen suspension i muskeln. Mät längden och bredden på varje plugg med ett bromsok. Rikta de dissekerade xenograft pluggarna på en skärbräda bredvid en linjal och ta en bild för att registrera den grova vascularity av skador.Sedan fixa pluggarna genom att dränka dem i 10%formalin över natten vid rumstemperatur. Efter dissektion bearbetas lesionspluggarna för histologisk analys och färgas för UEA-1 för att upptäcka mänskliga härledda endotelceller i pluggen. Ta fem HPF bilder per lesion avsnitt med en ljus fält mikroskop vid 20 X förstoring i ett X plan mönster inom lesion avsnitt för att undvika överlappning.Se till att inkludera ett skalstreck på de bilder som tagits. Öppna HPF-bilderna i J.To och kalibrera skallistens pixlar, använd verktyget för rak linje och gå över skallisten. Omvandla sedan de uppmätta pixlarna till millimeter genom att klicka på Analysera och Ange skala.Nästa klicka på Analysera Ange Mått och välj område och lägg till att överlägg. Mät den totala fältytan för HPF med hjälp av analysera och mäta spara denna mätning för kvantifiering. Använda verktyget fri hand val manuellt kontur UEA-1 positiva vaskulär kanal.Klicka på Analysera och mät för att kvantifiera det skisserade området. Mät alla vaskulära kanaler inom HPF. Upprepa processen för de fem HPF som tas inom varje avsnitt och överför värdena till Excel för vidare analys.Beräkna sedan andelen vaskulär område och vaskulär densitet enligt manuskriptet riktningar. Med hjälp av detta protokoll lesion pluggarna med TIE2 eller PIK3CA hyperaktiva mutanta endotelceller är visibly vascularized och perfused inom sju till nio dagar efter injektion. Lesion pluggar liknar nära de histopatologiska funktionerna i mänskliga VM vävnad och stora Vaskulär kanaler som anpassas av ett tunt lager av endotelceller är synliga.Dessa vaskulära strukturer innehåller typiskt erytrocyter bekräftar funktionella anastomos med värd musen vasculature. Immunohistochemical färgning med hjälp av den mänskliga specifika lectin UEA-1 bekräftar att cellerna foder kärlregioner härrör från mänskliga implanterade celler snarare än mus vasculature. Efter detta förfarande kan ytterligare färgning av lesion sektioner för markörer för spridning eller apoptos utföras för att analysera specifika effekter av experimentella behandlingar.Denna scenografiska modell har använts för prekliniska studier av nya terapier för venös missbildning, såsom mTOR-hämmaren rapamycin, som har visat effekt i flera kliniska prövningar för VM-patienter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Inrättande av en kliniskt relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock kataraktoperation Modell för utredning Epithelial sårläkning i en Native mikromiljö

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel Kultur Modell för Human pluripotenta stamceller Förökning på Gelatin i Placenta konditionerade Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Odling av Murina embryonala fotbenen: En fysiologisk modell av endokondral benbildning

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Läkemedelsbehandling och<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av Osteoblast-osteoklaster interaktioner i en Medaka Fish Osteoporos Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Snabb Isolering av BMPR-IB + Fett-stromala celler för användning i en calvarial defekt Healing Modell

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

En seminifera tubuli Squash teknik för Cytologisk analys av spermatogenesen använder musmodell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Partiell lobulär Hepatectomy: En kirurgisk modell för Morphologic lever regenerering

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

En musmodell distraktion Osteogenesis

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

En In Vitro -modell av ett parallell-plattan Perfusion System att studera bakteriell vidhäftning för att ympa vävnader

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...