Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

Yazarlar prova için Nora Lakes teşekkür etmek istiyorum. Bu el yazmasında bildirilen araştırma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından, Ödül Numarası R01 HL117952 (E.B.), Ulusal Sağlık Enstitüleri bir parçası altında desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC), Kanser ve Kan Hastalıkları Enstitüsü'nde kurumsal politikalara göre onaylı kurumsal inceleme kurulu (IRB) uyarınca Tümörlü ve Vasküler Anomalili Hastalardan Doku Örnekleri ve Verilerinin Toplanması ve Depolanmasının ve Klinik Araştırma Komitesi'nin onayı ile katılımcılardan hasta doku örnekleri alındı. Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri CCHMC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmış...

<ol>
	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

Burada, VM'nin hasta kaynaklı ksenogreft modelini oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu rüre modeli araştırmacılar patolojik lümen genişleme daha derin bir anlayış kazanmak için izin veren mükemmel bir sistem sunuyor ve VM tedavisi için daha etkili ve hedefli tedaviler geliştirilmesinde etkili olacaktır. Bu kolayca kapiller lenfatik venöz malformasyon16gibi vasküler anomalilerin diğer türleri araştırmak için adapte edilebilir. Tekrarlanabilir vasküler lezyonların ...

Vaskülatür gelişimindeki bozukluklar venöz malformasyon (VM) gibi birçok hastalığın altında yatan nedenlerdir. VM anormal morfogenez ve damar genişlemesi ile karakterize konjenital bir hastalıktır1. VM doku ve endotel hücreleri (EC) üzerinde yapılan önemli çalışmalar iki gende fonksiyon kazanım mutasyonları tespit etti: TEK, tirozin kinaz reseptörü TIE2 kodlayan, ve PIK3CA, p110α kodlayan (katalitik alt birim) PI3-kinaz (PI3K)2,,3,4,5. Bu somatik mutasyonlar, PI3K/AKT dahil olmak üzere anahtar anjiyojenik/büyüme sinyal yollarının ligand-bağımsız hiper aktivasyonuile sonuçlanır ve böylece dilate ektatik venler3ile sonuçlanır. Bu önemli genetik keşiflere rağmen, anormal anjiyogenezi tetikleyen sonraki hücresel ve moleküler mekanizmalar ve genişlemiş vasküler kanalların oluşumu hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Normal ve patolojik anjiyogenez sırasında, yeni damarlar önceden varolan vasküler ağdan filizlenir ve EC proliferasyon, göç, hücre dışı matriks (ECM) remodeling ve lümen oluşumu 6 dahil olmak üzere önemli hücresel süreçlerin bir dizi geçmesi6. EC'nin iki ve üç boyutlu (2D/3D) in vitro kültürleri bu hücresel özelliklerin her birini ayrı ayrı araştırmak için önemli araçlardır. Bununla birlikte, bir fare modeli ev sahibi mikro ortamda patolojik damar genişlemere açık bir talep ve çeviri araştırma için hedefli ilaçların preklinik değerlendirme için etkili bir platform sağlarken.
Bugüne kadar TIE2 fonksiyon artışı mutasyonları ile ilişkili vm transgenik bir murine modeli bildirilmemiştir. Mevcut transgenik VM fare modelleri, aktive mutasyonpik3CA p.H1047R3,5'inher yerde veya doku kısıtlamalı ekspresyonuna dayanır. Bu transgenik hayvanlar, bu sıcak nokta PIK3CA mutasyonunun tüm vücut veya dokuya özgü etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu modellerin sınırlandırılması erken öldürücülük ile sonuçlanan yüksek patolojik vasküler ağ oluşumudur. Bu nedenle, bu fare modelleri mutasyonel olayların düzensiz oluşumunu ve VM patolojisinin lokalize doğasını tam olarak yansıtmamaktadır.
Aksine, hasta kaynaklı ksenogreft modelleri transplantasyon veya patolojik doku veya immünoeksik fareler içine hastalardan elde edilen hücrelerin enjeksiyon dayanmaktadır7. Ksenogreft modelleri hastalık gelişimi ve yeni terapötik ajanların keşfi hakkında bilgi genişletmek için güçlü bir araçtır8. Buna ek olarak, hasta kaynaklı hücreleri kullanarak bilim adamları hasta fenotipspektrum çalışması için mutasyon heterojenite recapitulate sağlar.
Burada, TIE2 ve/veya PIK3CA'nın mutant-aktif formunu ifade eden hasta kaynaklı VM EC'nin atimik çıplak farelerin arkasına deri altı enjekte edildiği bir protokolü açıklıyoruz. Enjekte edilen vasküler hücreler önceki vasküler ksenogreft modellerinde açıklandığı gibi anjiyogenezi teşvik etmek amacıyla Bir ECM çerçevesinde askıya alınır9,10,11. Bu VM EC önemli morfogenez geçmesi ve destekleyici hücrelerin yokluğunda genişlemiş, perfüzyon patolojik damarlar oluşturmak. VM'nin açıklanan ksenogreft modeli, kontrolsüz lümen genişlemesini inhibe edebilmeleri için hedeflenen ilaçların klinik öncesi değerlendirilmesi için etkili bir platform sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

Venöz malformasyon (VM), venöz ağın bozulmuş gelişiminden kaynaklanan ve sıklıkla işlevsiz venlerle sonuçlanan vasküler bir anomalidir. Bu makalenin amacı, insan VM'sini taklit eden ve hasta heterojenliğini yansıtabilen bir murine ksenogreft modelinin kurulmasını dikkatle tanımlamaktır. VM'de patolojik damar genişlemesinin başlıca itici etkenleri olarak endotel hücrelerinde (EC) hiper-aktive edici olmayan (somatik) TEK (TIE2) ve PIK3CA mutasyonları tespit edilmiştir. Aşağıdaki protokol, mutant TIE2 ve/veya PIK3CA'yı ifade eden hasta kaynaklı EC'nin izolasyonu, saflaştırılması ve genişlemesini açıklamaktadır. Bu EC ektatik vasküler kanallar oluşturmak için immünoeksik atimik farelerin arkasına subkutan enjekte edilir. TIE2 veya PIK3CA-mutant EC ile oluşturulan lezyonlar enjeksiyondan sonraki 7\u20129 gün içinde gözle görülür şekilde vaskülarize edilir ve VM hasta dokusunun histopatolojik özelliklerini yeniden özetler. Bu VM ksenogreft modeli VM oluşumu ve genişlemesi sürüş hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için güvenilir bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu model insan VM görülen anormal damar genişlemesini önlemede yeni ilaç adaylarının etkinliğini test çeviri çalışmaları için etkili olacaktır.

Bu protokol, immünofif uyruvarlı çıplak farelerin arkasına hasta kaynaklı EC'nin deri altı enjeksiyonuna dayalı vm'nin bir murine ksenogreft modeli oluşturma sürecini açıklar. Endotel hücre kolonileri VM dokusundan veya lezyonal kandan ilk hücre izolasyonundan sonra 4 hafta içinde hasat edilebilir(Şekil 1A,B). Enjeksiyondan bir gün sonra, ksenogreft lezyon fişi yaklaşık 80\u2012100 mm2'likbir yüzey alanını kaplar. Elimizde TIE2/PIK3CA-mutant EC'li lezyon fişleri gözle ...

Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Venöz malformasyonun murine ksenogreft modelini oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Bu model, hiper aktive edici TIE2 ve/veya PIK3CA gen mutasyonları içeren hasta kaynaklı endotel hücrelerinin deri altı enjeksiyonuna dayanmaktadır. Ksenogreft lezyonları VM hasta dokusunun histopatolojik özelliklerini yakından özetler.

Venöz Malformasyon için Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modeli

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Bu protokol venöz malformasyonların histopatolojisini özetleyen hasta kaynaklı ksenogreftler oluşturmak için kullanılabilir. Bu daha bizim preklinik terapötik test taşımak için izin verildi. Bu teknik, hastanın doğrudan endotel hücrelerinin büyümesini ve deneysel tedaviye yanıtın günlük olarak izlenmesini sağlayan hızlı ve güvenilir bir NVivo sistemi sağlar.Bu yöntem, vasküler veya lenfatik anomalilerin diğer türlerini araştırmak için kolayca uyarlanabilir. Enjeksiyon için hücre süspansiyon hazırlayarak başlayın. Endotel hücrelerini beş mililitre önceden ısıtılmış %0.05 tripsin-EDTA ile 37 derecede iki dakika boyunca deneyin.Tripsin nötralize ve EGM beş mililitre ekleyerek ve 150 mililitre konik tüp içine hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 400 kez G santrifüj sonra supernatant aspire ve EGM üç mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücreleri hemositometreile say.İstenilen hücre sayısı ile hacmi yeni bir 50 mililitrelik konik tüp içine girişim ve santrifüj ile tekrar hücreleri pelet. Hücre peletgevşetmek için küçük bir hacim bırakarak supernatant aspire. Enjeksiyon başına 220 mikrolitre BMEM ile hücre peletini yeniden askıya alın.Kabarcıklar oluşturmamak için emin olmak için buz üzerinde iyice hücre süspansiyon karıştırın. BMEM hücre kültürünü, pistonu çekerek bir mililitrelik şırınga nın içine aspire edin. Şırıngaya 26 kalibrelik steril bir iğne kilitlersiniz ve hazırlanan şırıngaları enjeksiyondan önce buzun üzerinde sabit tutarsınız.Farenin düzgün bir şekilde anestezi altında olmasını sağladıktan sonra midesine yerleştirin ve enjeksiyon bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin. Yavaşça herhangi bir yerleşmiş hücreleri askıya almak için hazırlanan şırınga rulo. Gıyabın sonuna kadar kabarcıklar ve hücre süspansiyon küçük bir hacim sınırdışı.Yapı gibi bir çadır oluşturmak için enjeksiyon yerinde cilt çimdik. Sonra derinin altına iğne sağ yerleştirin ve iğne kas dokusuiçine enjeksiyonu önlemek için çimdik deri serbest bırakarak sadece derin olduğundan emin olun. İğneyi tutmak, küçük bir küresel kütle oluşturmak için hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini dikkatlice enjekte edin.Kas içine hücre süspansiyon enjekte önlemek için dikkat edin. Her fişin uzunluğunu ve genişliğini bir kaliper ile ölçün. Kesilen ksenogreft fişleri cetvelin yanındaki kesme tahtasına hizala ve lezyonların brüt vaskülaritesini kaydetmek için bir görüntü alın.Daha sonra fişleri oda sıcaklığında bir gecede %10 formalin batırarak düzeltin. Diseksiyondan sonra, lezyon fişleri histolojik analiz için işlenir ve fiş içinde insan kaynaklı endotel hücrelerini tespit etmek için UEA-1 için lekeli. Çakışmayı önlemek için lezyon kesitinde X düzlem deseninde 20 X büyütmede parlak alan mikroskobu ile lezyon kesiti başına beş HPF görüntü alın.Çekilen resimlere bir ölçek çubuğu eklediğinden emin olun. Görüntüdeki HPF görüntülerini açın J.To ölçek çubuğunun piksellerini kalibre edin, düz çizgi aracını kullanın ve ölçek çubuğunun üzerinden gidin. Ardından, Analiz et ve Ölçeği Ayarla'yı tıklatarak ölçülen pikselleri milimetreye dönüştürün.Sonraki tıklatıldığında Ölçümleri Analiz Et ve alanı seçin ve bindirmeye ekleyin. Analiz kullanarak HPF'nin toplam alan alanını ölçün ve bu ölçümü ölçmek için bu ölçüyü kaydedin. Ücretsiz el seçimleri aracını kullanarak UEA-1 pozitif vasküler kanalel olarak anahat.Ana hatlarıyla açıklanan alanı ölçmek için Analiz ve Ölçü'ye tıklayın. HPF içindeki tüm vasküler kanalları ölçün. Her bölümde alınan beş HPF işlemini tekrarlayın ve daha fazla analiz için değerleri Excel'e aktarın.Daha sonra el yazması yönlere göre vasküler alan ve vasküler yoğunluk yüzdesini hesaplayın. Bu protokol kullanılarak TIE2 veya PIK3CA hiperaktif mutant endotel hücreleri ile lezyon fişleri gözle görülür vaskülarize edilir ve enjeksiyondan sonraki yedi ila dokuz gün içinde perfüzyona alınır. Lezyon fişleri insan VM dokusunun histopatolojik özelliklerine çok benzer ve ince bir endotel hücresi tabakası ile hizalanmış büyük vasküler kanallar görülebilir.Bu vasküler yapılar genellikle ev sahibi fare vaskülatürü ile fonksiyonel anastomoz doğrulayan eritrositler içerir. İnsana özgü lektin UEA-1 kullanılarak yapılan immünohistokimyasal boyama, vasküler bölgeleri kaplayan hücrelerin fare vaskülatürü yerine insan implante edilmiş hücrelerden elde edildiğini doğrular. Bu prosedürü takiben, deneysel tedavilerin spesifik etkilerini analiz etmek için proliferasyon veya apoptoz belirteçleri için lezyon bölümlerinin ek boyanması yapılabilir.Bu scenografik model vm hastaları için çeşitli klinik çalışmalarda etkinliğini göstermiştir mTOR inhibitörü rapamisin gibi venöz malformasyon için yeni tedavilerin preklinik çalışmalariçin kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Gelişim Biyolojisi

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Kısmi Lobular Hepatectomy: Morfolojik karaciğer rejenerasyonu için cerrahi bir Model

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

Bir fare oyalama Osteogenesis modeli

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...