6.1K Views
•
10:39 min
•
September 17th, 2020
DOI :
September 17th, 2020
•0:04
Introduction
1:24
Identify Potential Genetic Interactions for Screening
2:35
Design the Cloning Strategy to Clone SIR2 into the pRS315 Vector
5:46
Transform the Vector into atg1△ and Wild Type Yeast Strains
7:32
Determine the Chronological Life Span to Test for Shortened CLS Phenotype Suppression
8:13
Results: Chronological Lifespan of atg1△+pRS315-SIR2
10:07
Conclusion
Transcript
Aldring er preget av den tidsavhengige forverringen av flere cellulære prosesser som til slutt øker sannsynligheten for organismedød. Innenfor en befolkning er denne prosessen variabel og en rekke genetiske og miljømessige faktorer kan påvirke den. En av de best studerte og forståtte variablene er rollen som diett på levetid.
Kostholdsbegrensning er en intervensjon som til slutt forsinker utbruddet av aldring og aldringsrelaterte endringer. Dette øker kroppens levetid og helsespenn, eller hvor lenge en organisme har et normalt, sunt liv. Vår nåværende forståelse har ført til identifisering av et distinkt sett med cellulære endringer som har blitt betegnet kjennetegnene til aldring, for eksempel akkumulering av mutasjoner, dysregulering av telomerer, tap av protein homeostase, respirasjonsproblemer og reaktive oksygenarter, blant andre.
Nå kommer mye av denne forståelsen fra studier som bruker mange forskjellige modellorganismer. Det har vært mange genetiske skjermer som har identifisert gener som både forkorter og forlenger levetiden. Og disse inkluderer studier i den spirende gjær saccharomyces cerevisiae, som er fokus for denne metodikken, samt studier i mer komplekse flercellede organismer, som C.elegans og murine systemet.
Av disse skjønt, den spirende gjær er spesielt mottagelig for aldring studier på grunn av sin korte naturlige levetid og en rekke genetiske tilnærminger som kan løse komplekse genetiske relasjoner, noe som gjør det til et utmerket system for funksjonell disseksjon av genetikk aldring. Gjær kan brukes til å studere flere forskjellige aspekter ved aldring. Og vi vil fokusere på kronologisk levetid, som er varigheten som en celle kan overleve.
Målet med dette arbeidet er å presentere en enkel genetisk tilnærming til å utføre en over-uttrykkssuppressorskjerm. Vi vil bruke en genetisk bakgrunn som resulterer i en unormalt forkortet kronologisk levetid. Og vi vil bruke en målrettet tilnærming til å identifisere gener som kan redde eller undertrykke den forkortede levetiden fenotype, forsøker å identifisere gener som gjenoppretter en normal levetid.
Den første genetiske bakgrunnen er en autofagi-mangelfull stamme av gjær. Autofagi, som løst oversettes som selvspisende, er et intracellulært nedbrytningssystem for å levere cytosoliske produkter, som proteiner og organeller, til lysosomet. Dette bidrar til å opprettholde cellulær homeostase ved å eliminere skadede proteiner, så vel som de som har overlevd livet.
Vi skal jobbe med en mutant stamme som har en sletting av ATG1 genet. ATG1 koder for en protein serine / treonin-protein kinase som er nødvendig for vesikkeldannelse og autofagi i cytoplasma-til-vacuole målretting banen. ATG1 null mutant har en fenotype for å ha en unormalt kort kronologisk levetid.
I dette aldrende laboratoriet vil vi designe og teste for genetiske faktorer som kan redde, eller undertrykke, den unormalt forkortede levetiden som er karakteristisk for ATG1 null mutant. Dette kan imidlertid utvides til andre kortvarige genetiske bakgrunner også. Det første trinnet i denne prosessen er å identifisere et gen som er knyttet til å forlenge levetiden.
Vi skal fokusere spesielt på genene som forlenger den kronologiske levetiden når de er overutseende. For å gjøre dette skal vi bruke de offentlig tilgjengelige dataene som er tilgjengelige fra gjærgenomdatabasen. Vi skal opp hit.
Søk etter fenotype. Og omtrent midtveis ned, vil vi se at vi kan velge kronologisk levetid. For å se etter gener som øker levetiden, er det du kan se vell av tilgjengelige data som har gener knyttet til denne fenotypen.
I dag skal vi studere SIR2, en histone lysin deacetylase som er knyttet til utvidet kronologisk levetid når den er overutsegelig. Det første vi vil gjøre er å få tilgang til DNA-sekvensen for kodingsområdet, samt de regulatoriske områdene som flankerer hver side av dette genet. Vi vil ta 400 basepar oppstrøms og nedstrøms for å være sikker på at vi omfatter alle regulatoriske regioner.
Vi vil bruke denne DNA-sekvensen til å designe PCR-primere som vil tillate oss å klone dette genet i vår plasmid vektor. Vi vil bruke PCR til å forsterke genet vårt og klone det inn i pRS315 vektor. For å gjøre dette, vil vi designe primere som inneholder begrensning fordøyelsesområder som innlemmer HindIII og SacII begrensning nettsteder.
Som du kan se, inneholder plasmid begge restriksjonssteder, HindIII og SacII, som vil lette vår kloning. Du bør designe PCR-primere for å inneholde ca 21 eller 22 nukleotider av sekvens gratis til regionen du vil forsterke. I tillegg til sekvensen, vil du legge til på de fem viktigste enden av dem riktig begrensningssted, enten HindIII på den fremre primeren, eller SacII på omvendt primer, vist her i henholdsvis rød og lilla, og videre oppstrøms av det, legg til flere nukleotider som vil tillate restriksjonen enzymet å binde og skape restriksjon fordøyelsesstedet ved en høyere effektivitet.
Vokse en fem milliliter kultur av vill type gjær over natten til post-log fase i beriket media, for eksempel YPAD. Høst genomisk DNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett som er spesifikt for soppgenomisk isolasjon. Det er viktig at settet er spesifikt for gjær, da de har en veldig stiv og tøff cellevegg å trenge inn i.
Zymolyase behandling er effektiv for å fordøye celleveggen og øker det genomiske utbyttet sterkt. Bruk et spektrofotometer for å bestemme mengden og kvaliteten på DNA. For å produsere en amplicon som er egnet for kloning, er det nødvendig å bruke en high fidelity PCR polymerase for å unngå mutasjoner under forsterkningsprosessen.
Det er mange forskjellige high fidelity PCR kits som er kommersielt tilgjengelig. For å lette optimaliseringen av reaksjonen anbefaler vi at du velger et sett som gir flere buffersystemer, en som er en standard høy gjengivelsesbuffer, og en optimalisert for høyt GC-innhold i komplekse amplikloner. Vi skal legge til 200 nanogram av vårt genomiske DNA.
Vi skal legge til fem mikroliter av bufferen vår. Vi kommer til å legge til 2 1 / 2 mikroliter av våre fremover og våre omvendte primere. Vi skal legge til en mikroliter av polymerasen vår, to mikroliter d NTPs.
Og til slutt skal vi til QS hele reaksjonen på 50 mikroliter med sterilt destillert vann. Vi vil kjøre reaksjonen i henhold til protokollen som er spesifikk for enzymet vi bruker, så vel som for primerne som vi har designet i dette eksperimentet. Opprydding og konsentrere PCR-reaksjonen.
Vokse en fem milliliter kultur av E.coli over natten i selektive medier. Pellet kulturen ved sentrifugering og kast overnatanten. Resuspend og lyse cellene i den medfølgende chaotropiske bufferen i fem minutter.
Nøytraliser reaksjonen og bland de to ved inversjon fem eller seks ganger. Sentrifuger prøven i 10 minutter med maksimal hastighet. Overfør det overnaturlige og til en silikakolonne og vask med den medfølgende bufferen.
Kast strømmen gjennom og gjenta vasken med de andre passende bufferne, med 30 andre sentrifuger i mellom, kaste strømmen gjennom etter hver. På slutten, sentrifuge i to minutter mer for å fjerne eventuelle gjenværende etanol og elute plasmid i 20 mikroliter elution buffer og bestemme mengden og kvaliteten ved spektrofotometer. Nå er det på tide å sette opp en begrensning fordøyelsen av vektoren og innsatsen.
Tilsett 625 nanogram DNA, enten vektoren eller innsatsen, fem mikroliter CutSmart buffer, en mikroliter SacII, en mikroliter hindiII, og QS reaksjonen med vann for å bringe det endelige reaksjonsvolumet til 50 mikroliter. Inkuber begrensningen fordøyer ved 37 celsius i tre timer, etterfulgt av 80 centigrad i 20 minutter for å varme og aktivere enzymene. På dette punktet kan fordøye lagres i fire grader før du går videre til neste trinn.
Deretter skal vi sette opp en 15 mikroliter ligation ved hjelp av vårt fordøyde genomiske fragment, samt vektoren som vi nettopp fullførte. Vi skal begynne med å tilsette seks mikroliter vann. Vi skal legge til to mikroliter av vår fordøyde vektor.
Dette er vår pRS315 plasmid. Vi skal legge til fire mikroliter av innsatsen vår, SIR2-genet. Vi skal legge til to mikroliter av vår ligase buffer, tilfelle 10X buffer.
Og til slutt skal vi legge til en mikroliter av ligase. Vi skal inkubere dette på 16 grader over natten, og deretter varme drepe enzymet på 80 grader celsius i 20 minutter. For å screene for vår vellykket plasmid, skal vi forvandle den til E.coli.
Vi skal bruke 50 mikroliter kjemisk kompetente celler. Vi skal tine dem på is, og så snart de tiner, skal vi legge til vår ligation reaksjon, vi skal legge hele innholdet i det. Så vi skal legge til 15 mikroliter av ligation med innsatsen, og vi skal legge til 15 mikroliter av vår no-insert kontroll også til en egen reaksjon.
Når det er lagt til, knipser du røret et par ganger for å blande det. Og vi skal inkubere dette på is. Etter å ha fullført den 30 minutters inkubasjonen på is, skal vi legge til prøvene våre i en 42 graders varmeblokk hvor vi vil inkubere og varmesjokk i 20 sekunder, hvilket punkt vil vi ta dem ut, og vi vil legge til gjenopprettingsmedier.
Etter varmesjokket skal vi tillate en restitusjonsperiode. Vi skal ta prøvene våre, og vi vil legge til 450 mikroliter soc-medier. Vi vil inkubere disse ved 37 grader celsius for å tillate plasmidene å bli plukket opp og for å tillate ampicillin resistens genet til å begynne å bli uttrykt.
Vi vil tillate disse prøvene å gjenopprette ved 37 grader i 45 minutter. Etter den inkubasjonen satte vi opp en rekke fortynninger, en til 10 og en til 100, og vi skal plate disse på LB / Amp media og la cellene vokse opp over natten. Vi vil plate dem ved hjelp av steril teknikk.
Vi tar riktig plate, som vi har merket tilsvarende og inneholder vår valgbare markør. Vi vil ta 150 mikroliter av vår forvandlede E.coli. Ved hjelp av en steril inoculating loop, vil vi deretter forsiktig spre cellene gjennom og over hele platen slik at vi får en fin jevn fordeling.
Når vi er ferdige med å plating alle våre fortynninger, vil vi inkubere disse platene over natten på 37 grader celsius for å se hva som vokser. Etter omtrent en dag, bør vi se kolonier vokser opp som forhåpentligvis inneholder plasmid vi prøvde å skape. De burde se omtrent slik ut.
Ved hjelp av steril teknikk, inokulere potensielle transformerende midler som vokste fra transformasjonen til fem milliliter LB pluss ampicillin etter den tidligere skisserte prosedyren. Isoler plasmidene fra alle potensielle transformanter og kjør en begrensning fordøyelsen som tidligere beskrevet. Kjør reaksjonsproduktene på en agarosegel, og sammenligne de potensielle transformantene med den tomme vektoren.
Lagre eventuelle transformanter som resulterer i eksisjon av en riktig størrelse innsats for videre studier. Etter å ha lykkes med å skape vår plasmid, skal vi forvandle den til ATG1 null gjær bakgrunn. Vi skal ta 15 mil celler og vi skal pellet dem, som jeg allerede har gjort her.
Etter at de har pelleted, fjerne YPAD media at de vokste i og vaske cellene med destillert vann. Etter det skal vi ta cellene, og vi skal gjenbruke dem om 100 millimolar litiumacetat. Vi skal bruke dem på ny i 200 mikroliter av det.
Resuspend cellepellet ved mild pipettering opp og ned. Del cellene i separate mikrodrivstoffrør for hver av transformasjonene du vil utføre, ved hjelp av 50 mikroliter av denne blandingen per transformasjon. Til hver av transformasjonene må du legge til 240 mikroliter på 50% PEG.
PEG er veldig viskøs, pipette og måle veldig nøye. Bland ved å pipetter etter tilsetning av PEG og etter hver og en av de ekstra komponentene. Deretter legger du til 36 mikroliter av ett molar litiumacetat, fem mikroliter av laksesperm DNA, eller annet bærer-DNA, som har blitt kokt i fem minutter og plassert på is, og til slutt fem mikroliter av plasmid for hver transformasjon du skal utføre.
Vortex hvert rør grundig å blande. Inkuber prøvene dine ved 30 grader celsius i 45 minutter. Varm sjokk dem på 42 celsius i 10 minutter, og vask deretter cellene en gang i sterilt vann, til slutt resuspending dem i 200 mikroliter sterilt vann.
Sett opp en til 10 og en til 100 fortynninger av hver av de forvandlede stammer av gjær og plate 150 mikroliter på SC minus leu plater for å velge for plasmids. Spre cellene jevnt og jevnt, og la platene tørke før de inverterer og inkuberer dem ved 30 grader celsius, slik at de kan vokse i 48 til 72 timer. Når vi har klonet genet vårt for å teste, tester vi effekten på organismens kronologiske levetid.
Vi vil vokse gjæren, overvåke antall levedyktige kolonidannende enheter som forblir som en funksjon av tid. Dyrke gjær først i 72 timer i SC minus leucin flytende medier med risting på 30 grader celsius. Ved hjelp av et hemocytometer, bestemme fortynningen som er nødvendig for å tillate deg å plate 500 celler.
Ved hjelp av steril teknikk, plate cellene på en SC minus leu plate, slik at den kan tørke og inkubere invertert i tre dager ved 30 grader celsius, da vil de vokse opp, og du kan score kolonien vekst og registrere det tidspunktet. Etter å ha laget platen, fortsett å inkubere gjæren din ved 30 grader celsius uten å riste. I utgangspunktet gjentar vi plating med ukentlige intervaller, tar hyppigere tidspunkter hvis våre foreløpige data antyder en undertrykkelse av den aldrende fenotypen.
For å bestemme prosent levedyktigheten normaliserer vi til dag en gang punkt for analyse. Pass på å plate samme fortynning ved hvert intervall. Fortsett med denne prosessen til du ikke lenger ser noen kolonier som vokser opp.
Det er nyttig å skrive inn informasjonen din i et Excel-regneark. Dette vil tillate deg å raskt bestemme levedyktigheten til hver belastning ved avslutningen av eksperimentet.
Her er en protokoll for å identifisere genetiske interaksjoner gjennom en økt kopi nummer suppressor skjerm i Saccharomyces cerevisiae. Denne metoden gjør det mulig for forskere å identifisere, klone og teste suppressors i kortvarige gjærmutanter. Vi tester effekten av kopinummerøkningen av SIR2 på levetid i en autofagi null mutant.
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved