Name: a suppressor screen for the characterization of genetic links regulating chronological lifespan in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2020-09-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

يود جيمس ت. أرنوني أن ينوه بدعم الطلاب في دورة تقنيات الحمض النووي المؤتلف في 2017 و2018 في جامعة ويليام باترسون الذين شاركوا في هذا المشروع منذ بدايته، ولكن لم تتجاوز جهودهم عتبة التأليف: كريستوفر أندينو، خوان بوتيرو، جوزفين بوزان، بريندا كالابا، بريندا كوباس، هيدلوف إسل دادزي، إرفين غامارا، ، وين كو، نيلسون ميخيا، هيكتور موتولا، ربيعا ناز، عبد الله عودة، بيرل باغوتان، دانيال رازائي، غابرييلا رئيس الجامعة، عايدة شونو، وماثيو سو. أنتم علماء عظماء وأنا أفتقدكم جميعاً!
الكتاب يود أن نعترف بالدعم الذي لا يقدر بثمن من التعليم وتكنولوجيا البحوث في جامعة وليام باترسون لمساعدتهم : جريج ماتيسون ، بيتر Cannarozzi ، روب ماير ، دانتي بورتيلا ، وهنري هاينيتش. كما يود المؤلفون أن ينوهوا بمكتب النيابة لدعم العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية، ومكتب العميد ومركز البحوث في كلية العلوم والصحة، ودعمهم لهذا العمل، وقسم علم الأحياء لدعم هذا المشروع.

1- تحديد التفاعلات الجينية المحتملة للفحص
<ol><li>تحديد الخلفية الوراثية (الخلفيات) للتوصيف، التي تؤدي إلى فترة حياة زمنية قصيرة بشكل غير طبيعي (CLS) في Saccharomyces cerevisiae باستخدام قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces (SGD، https://www.yeastgenome.org29،30)،الذي يجمع المعلومات الظ...

إن كشف علم الوراثة عن الشيخوخة يشكل تحدياً صعباً، مع العديد من الفرص لمزيد من الدراسة التي يمكن أن تسفر عن رؤى كبيرة في التفاعلات المعقدة الموجودة. هناك العديد من الطرق التي تسمح للجيل السريع من المسوخ فقدان وظيفة لدراسة سلالات فارغة من الخميرة45،46. هذه الطر...

الشيخوخة هي فقدان السلامة التي تعتمد على الوقت في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تزيد في نهاية المطاف من احتمال موت الكائنات الحية. الشيخوخة أمر لا مفر منه تقريبا لجميع الأنواع. على المستوى الخلوي هناك العديد من السمات المميزة التي تتميز جيدا التي ترتبط بالشيخوخة، بما في ذلك: عدم الاستقرار الجينومي، والتعديلات اللاجينية، وفقدان بروتيوستاسيس، الخلل الميتوكوندريا، واستشعار المغذيات غير منظم، والشيخوخة الخلوية، والاستنزاف التيلومير1،2. في الكائنات وحيدة الخلية، مثل الخمائر، وهذا يؤدي إلى الحد من إمكانية التكرار والعمر الزمني3،4. تظهر هذه التغيرات الخلوية في الكائنات الحية الأكثر تعقيدًا ، مثل البشر ، كالأمراض التي تشمل السرطانات ، وفشل القلب ، والتنكس العصبي ، والسكري ، وهشاشة العظام5،6،7. على الرغم من التعقيدات العديدة التي تميز عملية الشيخوخة ، هناك الحفاظ على هذه السمات الجزيئية الكامنة في هذه العملية عبر الكائنات الحية المتباينة على نطاق واسع8،9،10. أدى تحديد التعديلات على هذه المسارات أثناء الشيخوخة إلى إدراك أنه يمكن التلاعب بها عن طريق تغيير نمط الحياة – يظهر التقييد الغذائي لإطالة عمر الحياة بشكل كبير في العديد من الكائنات الحية11. هذه المسارات تتلاقى وتتقاطع مع بعضها البعض ومع العديد من المسارات الأخرى، بطرق معقدة. إن توضيح وتوصيف هذه التفاعلات يوفر إمكانية التدخلات العلاجية لإطالة العمر والصحة12،13،14.
حفظ الأسس الجزيئية للشيخوخة يسمح للتشريح الوظيفي للتفاعلات الوراثية الكامنة وراء العملية من خلال استخدام أبسط الكائنات الحية نموذج – بما في ذلك في الخميرة في مهدها, Saccharomyces cerevisiae15,16. هناك نوعان من الشيخوخة الراسخة على غرار الخميرة في مهدها: الشيخوخة الزمنية (العمر الزمني، CLS) والشيخوخة المتماثلة (عمر النسخ المتماثل، RLS)17. يقيس التقادم الزمني مقدار الوقت الذي يمكن أن تبقى الخلية في حالة غير منقسمة. وهذا مشابه للشيخوخة التي ينظر إليها في الخلايا التي تنفق غالبية حياتهم في G0, مثل الخلايا العصبية4. بدلاً من ذلك، عمر تكراري هو عدد المرات التي يمكن أن تقسم خلية قبل الإرهاق وهو نموذج لأنواع الخلايا النشطة mitoticly (على سبيل المثال، عدد الخلايا البناتية التي يمكن أن يكون خلية)18.
الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم بروتوكول يسمح بالتشريح الوظيفي لعلم الوراثة من الشيخوخة باستخدام S. cerevisiae. في حين كانت هناك العديد من الدراسات الممتازة التي قام بها العديد من الباحثين والتي أدت إلى فهمنا الحالي ، لا تزال هناك العديد من الفرص المتاحة للباحثين الناشئين للمساهمة في مجال الشيخوخة من وقت مبكر في حياتهم الأكاديمية. نقدم منهجية واضحة من شأنها أن تسمح للباحثين للمضي قدما في مجال الشيخوخة. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون في متناول جميع الباحثين بغض النظر عن المرحلة في حياتهم الأكاديمية من خلال توفير الأدوات اللازمة لصياغة واختبار فرضياتهم الجديدة. وميزة نهجنا هو أن هذه طريقة فعالة من حيث التكلفة يمكن الوصول إليها بسهولة لجميع الباحثين بغض النظر عن المؤسسة – ولا تتطلب معدات مكلفة ومتخصصة ضرورية لبعض البروتوكولات19. هناك عدة طرق مختلفة لتصميم هذا النوع من الشاشة ، والنهج المبين في هذا العمل هو قابل بشكل خاص لفحص المسوخ فارغة من الجينات غير الأساسية التي تظهر انخفاضا حادا في العمر الزمني مقارنة سلالة ايزوجيني البرية من الخميرة.
كدليل لدينا من حيث المبدأ، ونحن استنساخ SIR2، وهو deacetylase lysine ذكرت كما عرض كل من امتداد وCLS تقصير عندما overexeded. تم العثور مؤخرا على OVEREXPRESSION SIR2 لزيادة CLS في الخمائر صناعة النبيذ; ومع ذلك، فقد أبلغت عدة مجموعات لا توجد صلة بين SIR2 وCLS التمديد، وترك دورها تحت20،21،22. بسبب هذه التقارير المتضاربة في الأدبيات، اخترنا هذا الجين لإضافة بحث مستقل للمساعدة في توضيح دور SIR2 في الشيخوخة الزمنية، إن وجدت. بالإضافة إلى ذلك، زيادة عدد نسخة من homologue SIR2 يمتد عمر في نظام دودة nematode نموذج23.
Autophagy هو نظام تدهور داخل الخلايا لتقديم منتجات cytosolic ، مثل البروتينات والعضيات ، إلى lysosome24. يرتبط Autophagy ارتباطا وثيقا بطول العمر من خلال دوره في البروتينات التالفة المتدهورة والعضيات للحفاظ على التوازن الخلوي25. يعتمد تحريض autophagy على تنسيق التعبير عن العديد من الجينات ، وحذف جين ATG1 النتائج في CLS قصيرة بشكل غير طبيعي في خميرة26في مهدها. رموز ATG1 للبروتين سيرين / ثريونين كيناز المطلوب لتكوين الحوية في autophagy وسيتوبلازم إلى vacuole (ما يعادل lyosomal الفطرية) المسار27,28. هنا، نقدم طريقتنا لزيادة عدد الشاشة نسخة، واختبار تأثير زيادة نسخة SIR2 على CLS في نوع البرية وsهوة - خلفية فارغة atg1. وهذه الطريقة قابلة بصفة خاصة للباحثين المبتدئين ومجموعات البحث في المؤسسات الجامعية في المقام الأول، التي يخدم الكثير منها المجتمعات المحلية الممثلة تمثيلا ناقصا في العلوم وتكون مواردها محدودة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fungal/Bacterial DNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIIIHF enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0157S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suppressor screen for the characterization of genetic links regulating chronological lifespan in saccharomyces cerevisiae

الشيخوخة هي التدهور الزمني الذي يعتمد على العمليات البيولوجية الطبيعية للكائن الحي الذي يزيد من احتمال الوفاة. العديد من العوامل الوراثية تساهم في التعديلات في عملية الشيخوخة الطبيعية. وتتقاطع هذه العوامل بطرق معقدة، كما يتضح من ثروة الروابط الموثقة التي تم تحديدها وحفظها في العديد من الكائنات الحية. تركز معظم هذه الدراسات على فقدان الوظيفة، والمسوخ الفارغة التي تسمح بالفحص السريع للعديد من الجينات في وقت واحد. هناك عمل أقل بكثير يركز على وصف الدور الذي فرط التعبير عن جين في هذه العملية. في العمل الحالي، ونحن نقدم منهجية واضحة لتحديد واستنساخ الجينات في الخميرة في مهدها، Saccharomyces cerevisiae، للدراسة في قمع نمط نمط العمر الزمني قصير الأجل ينظر في العديد من الخلفيات الوراثية. وقد صُمم هذا البروتوكول ليكون في متناول الباحثين من طائفة واسعة من الخلفيات وفي مختلف المراحل الأكاديمية. تم اختيار الجين SIR2 ، الذي رموز لديسيتيلاز هيستون ، للاستنساخ في ناقلات pRS315 ، كما كانت هناك تقارير متضاربة حول تأثيره على العمر الزمني. SIR2 أيضا يلعب دورا في autophagy، والتي تنتج عندما تعطل عن طريق حذف العديد من الجينات، بما في ذلك عامل النسخ ATG1. كدليل على المبدأ، ونحن استنساخ الجين SIR2 لأداء شاشة القامع على عمر تقصير النمط الظاهري سمة من autophagy ناقص atg1Δ mutant ومقارنتها بخلاف ذلك isogenic، نوع البرية نوع الخلفية الوراثية.

كما أن هناك تقارير متضاربة حول دور SIR2 أثناء الشيخوخة، اخترنا هذا الجين للدراسة باعتبارها القامع المحتملة لـ atg1Δ mutant's shorten CLS النمط الظاهري26. دور SIR2 هو مثير للجدل إلى حد ما, مع تقارير متضاربة حول دورها في تمديد CLS, ومع ذلك فقد تم ربطها بوضوح إلى زيادة CLS في خلفية الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

هنا هو بروتوكول لتحديد التفاعلات الجينية من خلال زيادة عدد الشاشة عدد في Saccharomyces cerevisiae. هذه الطريقة تسمح للباحثين لتحديد واستنساخ واختبار القامع في المسوخ الخميرة قصيرة الأجل. نحن اختبار تأثير زيادة عدد نسخة من SIR2 على عمر في متحولة فارغة autophagy.

شاشة القامع لتوصيف الروابط الوراثية التي تنظم العمر الزمني في Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في<em&gt; ساكاروميسز سيريفيسياي</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع للأنوبلويدي

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...