Med explosionen av nya material för medicinska tillämpningar bör den första screeningen göras systematiskt, så detta protokoll kan vara ett grundläggande verktyg för forskare som syftar till att utveckla och karakterisera nya biomaterial. Metoden möjliggör kvantitativ och kvalitativ utvärdering av cytotoxicitet och bioaktivitet hos biomaterial och farmaceutiska formuleringar, både fasta och flytande. Efter cellexponering kan flera kompletterande analyser utföras.
Fastställandet av cytotoxicitet för biomaterial kan ha relevanta konsekvenser för klinisk praxis. Till exempel kan denna kunskap ge klinikern möjlighet att välja det mest lämpliga biomaterialet för en specifik patient eller tillstånd. Detta protokoll möjliggör karakterisering av nya biomaterial inom olika områden såsom tandvård, ortopedi, kirurgi, oftalmologi, kardiologi, bland andra.
Utvärderingsresultaten bör göra det möjligt att dra slutsatser om biomaterialets bioaktivitet i levande vävnader förutom cytotoxicitet. Så nära experimentets början som möjligt, använd en spatel för att ladda det nyberedda biomaterialet i PVC-formarna och låt materialet ställa in under lämplig tid vid rumstemperatur. När materialet har stelnat, ta bort pelletsen från formarna och placera dem i en behållare av lämplig storlek.
Sterilisera sedan pellets under en ultraviolett ljuslampa i 20 minuter per sida. För att extrahera biomaterialen från pelletsen, placera de steriliserade pelletsen i ett 50 ml rör och tillsätt lämpligt cellodlingsmedium till pelletsen. Placera rören vid 37 grader Celsius i 24 timmar.
Nästa dag, använd färskt medium för att späda extraktet till lämpliga volymer av intresse. För att utvärdera cellmorfologin som svar på exponering för biomaterial, använd steril pincett för att placera ett sterilt glastäcke av lämplig storlek i varje brunn på en flerbrunnsplatta. Lägg till celler till varje täckglas i tillräcklig koncentration och placera i inkubatorn över natten.
Tillsätt lämplig volym av extraktspädningen av intresse till varje brunn och återför cellerna till cellodlingsinkubatorn under lämplig inkubationsperiod. Vid slutet av inkubationen aspireras supernatanten från varje brunn så att täckglasen torkar vid rumstemperatur. När proverna har torkat, täck varje täckglas med en tillräcklig volym May-Grunwald-lösning för en inkubation på tre minuter vid rumstemperatur.
Efter avlägsnande av färgämnet, tvätta täckglasen med en lämplig volym destillerat vatten i en minut, följt av en 15 minuters inkubation i en tillräcklig volym Giemsa-lösning. Vid slutet av inkubationen, tvätta täckglasen i rinnande vatten och avbilda cellerna med ljusmikroskopi. För att bedöma cellfunktionen genom utvärdering av proteinuttryck efter exponering för biomaterialet av intresse som visats, tvätta varje brunn av celler med PBS innan cellerna fixeras med 3,7% paraformaldehyd i 30 minuter vid rumstemperatur.
Vid slutet av inkubationen tvättas cellerna två gånger med PBS och permeabiliserar cellerna med 0,5% Triton i PBS i 15 minuter. Vid slutet av permeationen, blockera peroxidaset med 0,3% väteperoxid i PBS i fem minuter, följt av två tvättar med PBS. Efter den andra tvätten, tvätta cellerna två gånger med 0,5% BSA innan du blockerar den icke-specifika bindningen med 2% BSA i 45 minuter.
Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna en gång med 0,5% BSA innan du inkuberar cellerna med en primär antikropp mot proteinet av intresse i 60 minuter vid rumstemperatur, följt av fem tvättar med färsk 0,5% BSA. Efter den sista tvätten, inkubera cellerna med lämplig sekundär antikropp av intresse i 90 minuter vid rumstemperatur, följt av fem en minut tvättar i 0,5% BSA. Efter den sista tvätten, inkubera cellerna med ett lämpligt substrat och kromogen blandning vid 20 mikroliter kromogen per ml substratkoncentrationer i 25 minuter.
Vid slutet av inkubationen tvätta kulturerna två gånger med 0,5% BSA i PBS och motfärga cellerna med hematoxylin i 15 minuter. Tvätta de motfärgade cellerna i fem minuter med 0,037 mol per liter ammoniak. Tvätta sedan i fem minuter med destillerat vatten för att avlägsna överflödigt färgämne och använd glycerol för att montera täckglasen på objektglas.
För att bedöma bildandet av mineraliserade avlagringar i de extraktbehandlade cellkulturerna, tvätta varje brunn tre gånger med PBS innan cellerna fixeras med 4% paraformaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter den sista tvätten, färga cellerna med en lämplig volym alizarinröd färgningslösning i 20 minuter vid 37 grader Celsius i mörkret. Vid slutet av inkubationen, tvätta brunnarna med PBS tills överskottsfärgen har avlägsnats helt och avbilda cellerna med ljusmikroskopi.
Tillsätt sedan extraktionslösning till varje brunn under en 40 minuters inkubation under omrörning vid rumstemperatur och mät absorbansen i varje brunn på en spektrofotometer vid en våglängd på 490 nanometer. En MTT-analys kan användas för att få en översikt över materialens cytotoxicitet på ett snabbt och enkelt sätt mätt genom dess effekter på metabolisk aktivitet. Cellviabilitetsanalyser möjliggör också utvärdering av cytotoxiciteten hos ett material av intresse, eftersom material med högre cytotoxicitet inducerar en högre andel celldöd vid samma koncentration.
Minskningar på mer än 30 % anses vara kritiska och definierar material som riskområden med låg biokompatibilitet. Dessutom kännetecknas mer cytotoxiska material av en accentuerad minskning av cellviabiliteten och en sen apoptos och nekroscelldödsprofil, medan mindre cytotoxiska material inducerar mindre celldöd och en mer apoptotisk och sen apoptotisk profil. Morfologisk utvärdering kompletterar utvärderingen av cellviabilitet, eftersom förändringar i cellmorfologin kan indikera en apoptotisk eller nekrotisk profil, samt avslöja närvaron av materialpartiklar.
Dessutom kan effekterna av material av intresse på proteinuttryck observeras oberoende av effekter på livskraften. Till exempel, i denna analys, inducerade ett material en ökning av proteinuttrycket, medan det andra främjade en signifikant minskning. I båda fallen påverkade koncentrationen av extrakten direkt proteinuttrycket.
I extraktberedningen är lämpliga förhållanden mellan biomaterialytan och medelvolymen avgörande. Dessutom måste proverna steriliseras med metoder som inte förändrar deras egenskaper. En annan detalj att komma ihåg är extrakt pH, som bör registreras utan justering.
Utför ytterligare kontroller om det behövs. Biomaterialextrakten kan användas för kemi- och biokemistudier, liksom för flera andra molekylärbiologiska tekniker. Erhållna resultat utgör grunden för framtida biokompatibilitetstester in vivo.
Cytotoxicitetsutvärdering är avgörande för utvecklingen av material avsett för medicinskt bruk. Därför ger detta protokoll ett systematiskt och omfattande tillvägagångssätt för att utvärdera nya biomaterial eller nya tillämpningar av andra som redan finns inom olika medicinska områden.