Name: whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography
Uploaded: 2020-09-02T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography at JoVE.com

لم يكن أي من هذا ممكنا لولا دعم ناصر روسان. وأود أن أشكر H. دوغ موريس، دانييل دوناهو، وبريندا كلاونبرغ من مرفق التصوير الماوس NIH وبن أش من الضوئيات الصغيرة للتدريب والمناقشة المفيدة. كما أشكر منصورة نوروزي راد من زايس على مسح عينات البطن على زرادية 520 فيرسا. لورين سميث، سامانثا سميث، وراشيل نغ ساعدت أيضا في المسح الضوئي. مايك مارش من أنظمة أبحاث الأجسام قدم الدعم التقني اليعسوب. كما أنني ممتن للدعم المقدم من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (1K22HL137902-01) وصناديق البدء من جامعة وايومنغ. كما أشكر المراجعين المجهولين على اقتراحاتهم وتعليقاتهم المفيدة.

ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي مصالح منافسة أو مالية.

ظل تصور Drosophila melanogaster سليما في جميع مراحل النمو تحديا ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عدم توافق المجهر الخفيف مع بشرة سميكة مصطبغة موجودة في هذا الحيوان. في حين أن طرق التصوير الحيوانية الكاملة الأخرى ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) ، والتنظير الفائق إلى جانب تطهير الأنسجة قد استخدمت بنجاح في الذباب50،51،52،53،54، μ CT يقدم عددا من المزايا التي تجعله مثاليا للتصوير الحيواني الكامل لهذا الكائن الحي13،15،30 . تخترق الأشعة السينية البشرة المصطبغة بسهولة ويسمح طول موجتها الصغير بالتصوير دون الميكرون. وضع العلامات يتطلب الحد الأدنى من الاستثمار في المواد الكيميائية المتاحة على نطاق واسع وليس المهارات مقاعد البدلاء المتخصصة13. كما تتوفر الماسحات الضوئية μ-CT تجاريا، والتكاليف مماثلة لمنصات المجهر الخفيف، في حين أنها أكثر جاذبية لمجموعة أوسع من التخصصات (الجيولوجيا وعلم الحفريات والهندسة، وما إلى ذلك) التي يمكن أن تستفيد أيضا من توافرها في مؤسسة ما. يمكن أيضا استخدام مصادر Synchrotron X-Ray للتصوير عالي الدقة μ CT للحشرات الثابتة والحية31و55و56، ولكنها أقل سهولة من الماسحات الضوئية التجارية على سطح المقعد.
يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة للحصول على صور μ CT للبالغين الذباب والجراء واليرقات والأجنة الخلوية. لاحظ أنه بالنسبة للعديد من الخطوات الموضحة أعلاه، يمكن أيضا تطبيق طرق بديلة لإعداد عينات للتصوير. وقد قدمت دراسات أخرى مقارنة مفصلة لمختلف التثبيت، ووضع العلامات، وتجفيف الخطوات لاستخدامها في الحشرات ويتم تشجيع المهتمين في اعتماد هذه التقنية لتقييم مزايا كل نهج1،4،13،29،30،57. وفي حين أن هذا البروتوكول بسيط نسبيا، فإن بعض الاقتراحات المفيدة تقدم.
أولا، ينبغي توخي الحذر عند تعطيل كندل العينات سليمة بحيث لا تتعطل الأنسجة الرخوة الكامنة بشكل كبير. من المهم السماح لليرقات والمراحل المبكرة من الجراء بالخضوع للتثبيت لمدة ساعتين في محلول بوين قبل الوخز. وهذا سوف تصلب الأنسجة والحد من كمية الهيموليم التي سوف تتسرب من ثقوب كتيكل، والتي يمكن أن تغير بنية الجهاز. يمكن فصل أجزاء الجسم الفردية (الرأس والصدر والبطن) للبالغين إذا كان الهيكل (الهياكل) ذات الاهتمام موجودا هناك. من المستحسن استخدام مشرط لشريحة نظيفة من خلال هذه الشرائح بدلا من سحبها بعيدا مع ملقط، والتي يمكن أن تعطل العمارة 3D من القناة الهضمية أو الجهاز العصبي المركزي، على سبيل المثال. أما بالنسبة للتوقيت، يحتاج البالغون عادة إلى 16 ساعة فقط. لتثبيت كامل، في حين أن مراحل اليرقات والجراء تحتاج إلى 24 ساعة. أيضا، إذا اليود أو تلطيخ PTA يبدو متفاوتا، يمكن وضع العينة مرة أخرى في الحل لاحتضان لفترة أطول حتى يتم تحقيق تلطيخ حتى. وأخيرا، لا ينبغي وضع عينات رطبة في 4 درجة مئوية، لأن هذا يبدو للحث على تشكيل فقاعات الهواء داخل تجويف الجسم بعد الاحترار لدرجة حرارة الغرفة.
ثانيا، سوف تختلف العينة المتصاعدة حسب الأداة ونوع المرحلة وما إذا كانت العينة تحتاج إلى البقاء رطبة أو تم تجفيفها في نقطة حرجة. إذا كان رطبا، تأكد من عدم تسرب العينة وربما تدمير الماسح الضوئي. عند تركيب العينة داخل طرف ماصة، تأكد من دفع بلطف مع كائن مملة حتى العينات يواجه مقاومة طفيفة ولا يمكن أن تتحرك. دفع من الصعب جدا يمكن أن يؤدي إلى تشوه لطيف والعيوب الهيكلية الكامنة. تأكد أيضا من محاذاة العينة في الحامل أقرب ما يمكن إلى محور الدوران. أي تمايل سيزيد من أوقات المسح الضوئي بسبب مجال الرؤية الأكبر ويقلل من دقة مخطط الكائنات المبرمج النهائي بعد إعادة الإعمار.
ثالثا، ستختلف إعدادات الماسح الضوئي للحصول على صور الإسقاط أيضا حسب الأداة. ولزيادة قدرات دقة الماسح الضوئي إلى أقصى حد، ينبغي أن يكون حجم بقعة شعاع الأشعة السينية صغيرا قدر الإمكان (5-10 ميكرومتر). ويمكن تحقيق ذلك من خلال تحقيق التوازن بين الجهد الأشعة السينية والإعدادات الحالية بحيث أن مجموع الطاقة هو 3-4 واط. مع هذه الإعدادات ووقت التعرض المناسب على الكاميرا ، يمكن تحقيق التوهين المناسب لأشعة X-ray بواسطة العينة والتباين الأمثل للصورة. يمكن استخدام مرشحات الألومنيوم أو النحاس بين الجسم ومصدر الأشعة السينية لضبط إعدادات الطاقة بالأشعة السينية المثلى للحصول على أفضل تباين للصورة أو توهين الشعاع بما يكفي لاستخدام المصادر التي تعمل بالطاقة العالية. أما بالنسبة لدقة الصورة، فإن هذا يعتمد على العديد من المتغيرات المختلفة، بما في ذلك نوع البقعة، وعدد صور الإسقاط، وحجم بيكسل الصورة، وموضع الكاميرا، وحركة العينة، واهتزازات الماسح الضوئي، ومعلمات إعادة البناء. يمكن أن يساعد شبح نمط الشريط (QRM GmbH) الذي يحتوي على علامات الحجم المعروفة في تقييم الدقة المكانية لإعداد ماسح ضوئي وكاميرا معينين.
ومن الجدير أيضا تقييم مزايا التصوير نقطة حرجة المجففة أو عينات رطب. قام Sombke وآخرون بتقييم مقارن للم طريقتين ووجدوا أن تجفيف النقاط الحرجة متفوق لتطبيقات μ CT التي تنطوي على المفصليات30. ومع ذلك، فإن فوائد العينات المائية هي أن الحيوانات تتعرض لتعرض أقل للمواد الكيميائية والميكانكية التي يمكن أن تؤدي إلى كل من التحف الكمية والمورفولوجية. هذا يميل أيضا إلى الحفاظ على الأنسجة الحساسة أفضل من CPD. ومع ذلك ، فإن العينات المائية لها عمر صلاحية أقصر بكثير ويجب تصويرها في موعد لا يتجاوز شهرا واحدا بعد التثبيت نظرا لأن تدهور الأنسجة وانخفاض جودة الصورة يصبحان واضحين في تلك المرحلة. أيضا، فإن القرار من عينات رطب يكون أقل قليلا من عينة المجففة نقطة حرجة، لأن الأشعة السينية يجب أن تخترق أيضا من خلال كل من طرف ماصة بلاستيكية والسائل المحيط بها (الماء أو العازلة). يمكن الحفاظ على عينات النقطة الحرجة المجففة لفترات أطول بكثير من الزمن ، خاصة عندما تبقى على Drierite. كما يمكن وضعها مباشرة في مسار شعاع الأشعة السينية ببساطة عن طريق لصق الأجنحة أو الساقين إلى دبوس حشرة ووضعه في مرحلة تشاك ، وتبسيط عملية التركيب. ومع ذلك ، فإن جفاف الإيثانول الواسع النطاق لهذه العينات يمكن أن يؤدي إلى انكماش الأنسجة وفقدان بنية الأنسجة الحساسة ، وهذا هو السبب في أنه من المهم إجراء مجموعة من تركيزات EtOH المتزايدة لتقليل هذه الآثار. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن جميع أشكال العلاج الكيميائي ، بما في ذلك تثبيت البارافورمالديهايد وحتى تلطيخ اليود يمكن أن يسبب انكماش الأنسجة58،59. في حين أن أيا من الأسلوبين لن توفر قياسات "حجم الجهاز الفعلي" في ذبابة حية ، فإن القياسات المورفومترية لا تزال صالحة عند مقارنة الحيوانات المتحولة والحيوانات البرية طالما يتم تنفيذ خطوات التثبيت والتلطيخ والتجفيف بشكل مماثل لكلا المجموعتين من العينات - ويفضل أن يكون ذلك بالتوازي.
في الختام، يوفر μ-CT أداة تصوير حيوانية كاملة مفيدة ل Drosophila33،34،35،36،37،38،39،40،41. وقد عرضت العديد من الدراسات الأخرى قوة هذه التكنولوجيا لفهم جوانب مختلفة من تصنيف الحشرات، والبيئة، وعلم وظائف الأعضاء، والتنمية، والتشريح التي يمكن أن تساعد في إثراء الدراسات المستقبلية في الذباب1،28،30،31،32،55،56،57 . جنبا إلى جنب مع الأدوات المجهرية الوراثية والخفيفة المستخدمة بالفعل على نطاق واسع في هذا الكائن الحي، يمكن μ CT وضع نفسها داخل خط أنابيب تجريبي يسمح بفهم أعمق بين النمط الجيني والنمط الظاهري.

أثبتت طرق التصوير التي تسمح بإجراء تحقيق مفصل في الهياكل الداخلية للجسم دون تدمير هندسته المعمارية ثلاثية الأبعاد بشكل عام أنها مفيدة على نطاق واسع لعدد من التخصصات المختلفة ، بما في ذلك الفيزياء والهندسة وعلوم المواد وعلم الآثار وعلم الحفريات والجيولوجيا والبيولوجيا1و2و 3 و4و5و6و7و9 . من بين طرق التصوير غير التدميرية هذه ، تعد المنصات القائمة على الأشعة السينية مفيدة بشكل خاص نظرا لقدرة الأشعة السينية عالية الطاقة على اختراق العديد من أنواع العينات والمواد المختلفة مع الحد الأدنى من التشتت مقارنة بموجات الضوء المرئية. التصوير المقطعي المحوسب (CT) ، والتصوير المقطعي microcomputed (μ CT) ، والتصوير المقطعي النانوي (نانو CT) ، والتصوير الدقيق السنكروترون ، لذلك ، ظهرت كتقنيات أساسية للتصوير بالأشعة السينية على أساس عينات تتراوح من متر إلى ميكرون ، مع قدرات دقة ملليمتر إلى دون ميكرون10،11،12،13،14.
في حين تختلف هذه المنصات في تصميمها وهندسة الأشعة السينية والمكونات من أجل تحقيق التوازن بين حجم العينة والدقة ، إلا أنها تعتمد جميعا على نفس المبدأ الأساسي لالتقاط الصور: مصدر للأشعة السينية التي تنتقل عبر الجسم ويتم التقاطها بواسطة كاشف. التوهين التفاضلي لشعاع الأشعة السينية أثناء مروره عبر كثافات مختلفة داخل الجسم يولد تباين الصورة. يتم الحصول على البيانات ثلاثية الأبعاد عن طريق تدوير العينة أو الكاشف ، وجمع سلسلة من صور الإسقاط 2D التي يتم إعادة بنائها بعد ذلك باستخدام الخوارزميات في مخططات تحتوي على معلومات ثلاثية الأبعاد تكون دقتها متساوية في x،y،z15. بالنسبة للعديد من الماسحات الضوئية μ CT التي تستخدم هندسة الأشعة السينية ذات الحزمة المخروطية لإسقاط الأشعة السينية في الكائن الذي يتم تصويره ، يتم استخدام خوارزمية Feldkamp لإعادة بناء الكائن بدقة مع الحد الأدنى من الأخطاء16.
يتم تحديد دقة منصة معينة في المقام الأول من خلال معلمات النظام مثل حجم شعاع الأشعة السينية (حجم البقعة) ، وهندسة الماسح الضوئي (المسافة من الكائن إلى مصدر الأشعة السينية) ، وحجم البكسل على الكاشف ، وخوارزميات إعادة البناء المستخدمة. عوامل إضافية، مثل اهتزازات الماسح الضوئي، وتقلبات شعاع الأشعة السينية، وحركة العينة، ونوع المادة أو وصمة عار الكيميائية المستخدمة لتصور الكائن يمكن أن تؤثر أيضا بشكل كبير على القرار المكاني تحت condidtions التصوير في العالم الحقيقي15.
بالنسبة للتطبيقات الطبية الحيوية ، لعبت CT و μ CT دورا رئيسيا في تعزيز فهمنا لآليات التشريح وعلم وظائف الأعضاء والتنمية والمرض ، حيث كانت بمثابة أداة لتشخيص المريض البشري كمنصة تصوير ما قبل السريرية للكائنات الحية النموذجية17،18. على سبيل المثال ، فإن اتحاد ماوس الدولي للفينوتيبينج ، الذي يهدف إلى تحديد وظيفة كل جين في جينوم الماوس ، يستخدم μ CT كجزء من خط أنابيب phenotyping19. وكانت نتائجها حاسمة لفهم الجينات المشاركة في عمليات التنمية والمرض، في حين تعمل أيضا كأطلس لتشريح الفئران والتنمية20. الكائنات الحية نموذج آخر، مثل حمار وحشي والجرذان، كما احتضنت تماما استخدام μ CT لأداء phenotyping الحيوان كله من عدد من المسوخ الجينات17،21،22،23.
ميزة الجمع بين التصوير الحيواني كله مع الكائنات الحية النموذجية هو أن الفهم الآلي لوظيفة الجينات لعملية بيولوجية معينة يمكن استكشافها بالكامل. وهذا ممكن بسبب الجينوم المميز والعديد من الأدوات الجينية المتاحة في الكائنات الحية النموذجية التي تسمح بالتلاعب الدقيق بوظيفة الجينات في نقاط زمنية تنموية متميزة، وأنسجة محددة، وخلايا فردية، وحتى العضيات دون الخلوية. وتشمل هذه أنظمة التعبير الثنائي مثل نظام UAS /GAL4 (ومشتقاته العديدة) ، CRISPR / Cas9 ، وRNAi24،25،26. عندما يتم استخدام هذه الأدوات الوراثية جنبا إلى جنب مع خط أنابيب التصوير قوية تتكون من المجهر الإلكتروني، المجهر الخفيف (الفلورسنت وغير الفلورية)، والتصوير الحيواني كله مثل μ CT، يمكن تحقيق تقييم شامل للجزيئات والخلايا والأنسجة والأعضاء، والكائن الحي بأكمله، مما يسمح لفهم أعمق بكثير من وظيفة الجينات.
هذا البروتوكول يركز على استخدام μ CT في الكائن الحي نموذج غير الثدييات Drosophila melanogaster، الذي ساعد عدد لا يحصى من الأدوات الوراثية توضيح العديد من الآليات الجزيئية26،27. تم تبنيه من البروتوكولات السابقة في الحشرات غير النموذجية1،28،29،30،31،32، ويبني من دراسات μ CT السابقة في Drosophila لوضع بروتوكول موحد لاستخدامه في هذا الحيوان33،34،35،36،37،38،39 ,40,41. وترد الخطوط العريضة للخطوات اللازمة لنجاح إعداد العينات وتصويرها وتحليلها لمجموعات بيانات μ-CT التي تستخدم الماسحات الضوئية المتاحة تجاريا. مع هذا البروتوكول ، يمكن تصور جميع مراحل النمو من ذبابة في قرار عالية لكل من الوصفية والفرضية اختبار الدراسات ، بما في ذلك التصنيف والتشريح والتنمية وعلم وظائف الأعضاء ، والمرض27. سيكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا لتصوير أي حشرة تقريبا وحتى المواد غير الحية التي تتطلب تلطيخا كيميائيا لتباين الصورة لتعزيز التصور من خلال μ CT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For critical point drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>For animal fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragonfly Software</td>
			<td>Object Research Systems</td>
			<td></td>
			<td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Solution (I2KI)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan 1172</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &#181;m pixel size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>For poking hole in cuticle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon Image Reconstruction Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipet tips</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-120</td>
			<td>Sample mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Resarch Products International</td>
			<td>P32060-4000.0</td>
			<td>Dilute to 1X with water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25g</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>For Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>111036</td>
			<td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Xradia 520 Versa</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&#8482;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

تسمح أدوات التصوير الطبي الحيوي بالتحقيق في الآليات الجزيئية عبر المقاييس المكانية ، من الجينات إلى الكائنات الحية. وقد استفادت Drosophila melanogaster ، وهو كائن نموذجي يتميز بشكل جيد ، من استخدام المجهر الضوئي والإلكترون لفهم وظيفة الجينات على مستوى الخلايا والأنسجة. إن تطبيق منصات التصوير التي تسمح بفهم وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي السليم بأكمله من شأنه أن يزيد من تعزيز معرفتنا بالآليات الجينية. هنا يتم تقديم طريقة تصوير حيواني كاملة توضح الخطوات اللازمة لتصور Drosophila في أي مرحلة تنموية باستخدام التصوير المقطعي المجهري (μ CT). وتشمل مزايا μ-CT الأجهزة المتاحة تجاريا والحد الأدنى من الوقت العملي لإنتاج معلومات دقيقة ثلاثية الأبعاد بدقة على مستوى ميكرون دون الحاجة إلى طرق تشريح الأنسجة أو تطهيرها. يمكن إقرانها مع البرامج التي تسرع تحليل الصور وتقديم 3D ، وتحليل مورفوميتري مفصلة من أي نظام الأنسجة أو الجهاز لفهم أفضل لآليات التنمية وعلم وظائف الأعضاء ، والتشريح لكل من الوصفية والفرضية اختبار الدراسات. من خلال استخدام سير عمل التصوير الذي يتضمن استخدام المجهر الإلكتروني ، المجهر الخفيف ، μ CT ، يمكن إجراء تقييم شامل لوظيفة الجينات ، وبالتالي تعزيز فائدة هذا الكائن الحي النموذجي القوي.

ويبين الشكل 2 صورا لجنين، و3 يرقاتنجمية، وجراء في مرحلة البلوغ الفراتية (P7)، وذبابة أنثى بالغة ملطخة باليود ومصورة رطبة في الماء باستخدام ماسح ضوئي تجاري على سطح المقعد. الحفاظ الممتاز وحتى تلطيخ الأنسجة الحساسة واضحة ، مما يسمح بتحديد جميع الأعضاء الرئيسية بسهولة واستخدامها للتحليل المورفومتري والتصور ثلاثي الأبعاد.
عادة، توفر عمليات المسح التي تكتسب صورا إسقاط أقل للعينة دقة أقل من عمليات المسح التي تكتسب المزيد من صور الإسقاط، مع المفاضلة التي تقضيها في المسح الضوئي. على الرغم من أن أوقات المسح الضوئي ستختلف حسب الأداة ومعلمات المسح الضوئي الأخرى ، إلا أن عمليات المسح التي تكتسب بضع مئات من الإسقاطات (~ 3 ميكرومتر حجم بكسل الصورة) تستغرق حوالي 30 دقيقة لكل عينة ، في حين أن المسح الضوئي الذي يتكون من آلاف صور الإسقاط (700 نانومتر - 1.25 ميكرومتر حجم بكسل الصورة) يمكن أن يستغرق 8-16 ساعة. تظهر مقارنة من نفس الرأس يطير الكبار التي اتخذت في كل من 'بطيئة' (الآلاف من التوقعات) و 'سريع' (مئات من التوقعات) وضع المسح الضوئي في الشكل 3. الأهم من ذلك ، لا تختلف التحليلات المورفومترية بين المسح "البطيء" و "السريع" (الشكل 3C)40. لذلك، يستخدم خط أنابيب التصوير لدينا مسحا سريعا لتوليد حجم عينة كبير بما يكفي للتحليل المورفوميتري، وفحوصات بطيئة لتصور أي عيوب مورفولوجية أو تشريحية بدقة أعلى. باستخدام البرنامج (الخطوة 7) ، يمكن تقسيم أي نظام الأنسجة أو الجهاز من الفائدة واستخدامها لتحليل morphometric وتصور في 3D باستخدام صانع الفيلم(فيلم 1).
يظهر الشكل 4 مثالا على بطن الذبابة الملطخة ب PTA والمطبطبة المصورة (الماء) أو بعد تجفيف النقطة الحرجة (CPD) على مجهر الأشعة السينية (جدول المواد). التفاصيل التي يوفرها مزيج من منطقة التجارة التفضيلية وقدرات هذه المنصة واضحة بسهولة في هذه الصور ، بحيث يتم حل خلايا الظهارة الفردية لحزم midgut والحيوانات المنوية داخل الخصيتين بسهولة. في حين أن صورة CPD تظهر زيادة طفيفة في الدقة مقارنة بالعينة المائية ، يتم تحقيق الحفاظ بشكل أفضل على البنية الفائقة للأنسجة الحساسة (مثل الخلايا الدهنية بالقرب من البشرة) مع عينات رطبة(Movie 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على تصميم الماسح الضوئي وتركيب العينة μ CT. (أ) ماسح ضوئي تجاري μ-CT. (ب) عرض داخل الماسح الضوئي. يصدر مصدر الأشعة السينية (إلى اليمين) أشعة سينية تمر عبر العينة الموجودة على مرحلة دوارة (سهم أصفر). إن توهين هذه الأشعة السينية يولد تباينا في الصورة أثناء مرورها عبر العينة وعلى الكاشف، الذي يتكون من شاشة تلألؤ تحول الأشعة السينية إلى فوتونات وكاميرا CCD قياسية (يسار). (ج) تركيب ذبابة فاكهة الكبار للتصوير رطب في الماء. يتم لف نقاط الاتصال بين طرف ماصة وحامل النحاس في فيلم البارافين لمنع التسرب والأضرار المحتملة للماسح الضوئي. يتم تسليط الضوء أيضا على تشاك المرحلة. لاحظ أن طرف ماصة تم وضعه قليلا خارج المحور، مما أدى إلى وقت أطول المسح الضوئي وانخفاض القرار في إعادة الإعمار النهائي. (D) صورة إسقاط 2D واحدة من ذبابة أنثى بالغة؛ يتم الحصول على مئات إلى آلاف من هذه التوقعات أثناء المسح الضوئي على طول محور الدوران وتستخدم لإعادة الإعمار لتوليد توموجرامات تحتوي على دقة متساوية الخواص ومعلومات ثلاثية الأبعاد دقيقة. أشرطة المقياس (C) = 2 مم P، الخلفية؛ V، فينترال. وقد تم تعديل هذا الرقم من شوبورغوآخرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> الشكل 2: جميع مراحل دورة حياة دروسوفيليا ميلانوغاستر، التي تم تصويرها بواسطة μ-CT. عينات ملطخة باليود وصور رطبة في الماء. يظهر هو شريحة واحدة 2D. أ)جنين أكمل المراحل المبكرة من الاختراق (النجمة). (ب) يرقة نجمة ثالثة. (ج)A P7 فارات الكبار أثناء التحول. (د)أنثى بالغة. ويسلط الضوء على مختلف الأجهزة: BWM, عضلات جدار الجسم; Br, الدماغ; القرص المضغوط، كارديا؛ Cr, محصول; DLMs, العضلات الطولية الظهرية; DVM, عضلات البطن الظهري; E-AD، قرص هوائي العين؛ إم, جنين; FB, أجسام الدهون; FBCs, خلايا الجسم الدهنية; H, قلب; HG, هندغوت; لا، لامينا؛ L, ساق; مغ, ميدغوت; OL, الفص البصري الدماغ; أوف، أوفيبوستور؛ PC، كتل الجراء؛ SG, الغدد اللعابية; VNC, سلك العصب البطني; W, جناح; WD، قرص الجناح. أشرطة المقياس (A) = 100 ميكرومتر؛ (B)-(D) = 500 ميكرومتر. A, الأمامي; L، إلى اليسار. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (A، D) 36.5، (B) 48.8، (C) 40.3. مصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (A، D) 350، (B، C) 285. حجم بكسل الكاميرا (μm): (A-D) 11.6. حجم بيكسل الصورة (μm): (A، D) 1.2، (B) 1.9، (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> الشكل 3: لا تغير معلمات المسح الضوئي ودقة الصورة التحليلات المورفومترية. يتم مسح رأس شخص بالغ باستخدام إعدادات الماسح الضوئي(A و A)و (مئات الإسقاطات) و(B، B') إعدادات الماسح الضوئي "البطيئة" (آلاف الإسقاطات). الدماغ مبين باللون الأصفر. (ج) قياسات حجم الدماغ من المسح البطيء والسريع. أبرز الهياكل: AL; فص هوائي؛ CB, الدماغ المركزي; FB, مروحة على شكل الجسم; FCs, الخلايا الدهنية; لا، لامينا؛ لو، لوبولا؛ لوب، لوحة لوبولا. لي، medulla؛ إعادة، شبكية العين. ن = 5 ، ويلش تي الاختبار. ns = غير هام. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 44.4، (ب) 36.5. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 348 (ب) 350. حجم بكسل الكاميرا (μm): (A-B) 11.6. حجم بيكسل الصورة (μm): (A) 2.95، (B) 1.2. وقد تم تعديل هذا الرقم من شوبورغوآخرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> الشكل 4: Drosophila الميلانوغاستر البطن المصورة بواسطة المجهر بالأشعة السينية. كانت البطن ملطخة بنسبة 0.5٪ من PTA وصورت رطبة (ماء) أو بعد تجفيف النقاط الحرجة (CPD). (أ) نقطة حرجة المجففة البطن، هو مبين من منظور YZ و (A') XZ المنظور. (ب) البطن رطب، يظهر من منظور YZ و (B') XZ المنظور. يتم تسليط الضوء على مختلف الأجهزة: FC, الخلايا الدهنية; HG, هندغوت; مغ, ميدجوت; SP, مضخة الحيوانات المنوية; تي، الخصيتين. أشرطة المقياس (A) = 250 ميكرومتر D، دورسال؛ A, الأمامي; L، إلى اليسار. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 6.7، (ب) 7. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 28 (ب) 29.5. الهدف: (A-B) 4X. حجم بكسل الصورة (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
فيلم 1: يرقة نجمة ثالثة ، قدمت في 3D باستخدام صانع الفيلم في اليعسوب. وتشمل الأجهزة البارزة الدماغ (الأصفر) وأقراص العين الهوائية التصويرية (الأحمر) والجسم الدهني (الأزرق) وعضلات جدار الجسم (الخضراء). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 2: مقارنة العينات المصورة في الماء أو اتبع التجفيف نقطة حرجة. تظهر البطن ملطخة 0.5٪ PTA. تم مسح كلا البطنين بإعدادات حجم بكسل صورة متطابقة (0.65 ميكرومتر). تظهر سلسلة من الشرائح ثنائية الأبعاد في شكل "Z-stack" (YZ) بدءا من السطح الظهري وانتهاء على السطح البطني للبطن. أبرز الأجهزة: FC, الخلايا الدهنية; مغ, ميدجوت; SP, مضخة الحيوانات المنوية; تي، الخصيتين. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 6.7، (ب) 7. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 28 (ب) 29.5. الهدف: (A-B) 4X. حجم بكسل الصورة (μm): (A-B) 0.65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography at JoVE.com

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

يتم تقديم بروتوكول يسمح بتصور Drosophila melanogaster سليمة في أي مرحلة من مراحل التطوير باستخدام التصوير المقطعي microcomputed.

التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

تربية ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تحت ممحوضة ومعروف المعايشات شروط

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

التصوير من التعديلات خلية الشكل والحركة الخلية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المعيدة عن طريق DE-كادهيرين مراسل الذباب المعدلة وراثيا

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

تصور آثار الضرر التأسدي على غرف البيض Drosophila باستخدام التصوير الحي

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...