Общая цель этого исследования заключается в том, чтобы показать, как реализовать автоматизированные процедуры для культивирования и дифференциации клеток IPS человека в нейрональных линий, а также их автоматизированной визуализации. Стандартизированные автоматизированные процедуры позволяют низко экспериментальные изменения при обеспечении высокой фенотипической воспроизводимости. Кроме того, система может быть адаптирована для разработки новых протоколов.
Демонстрация процедур будет Иоахим Тагер и Elisangela Брессан, пост-документы из нашей лаборатории. В графическом пользовательском интерфейсе автоматизированной системы щелкните представление инструмента ресурса и выберите процесс инструментов ресурса. Нажмите запустить процесс инструмента и запустить запустить HEPA капот и процессы перезагрузки.
Выберите ресурсы для загрузки, откройте дверь и загрузите пластины культуры ячейки и одноразовые советы в соответствующих положениях, как указано на всплывающих изображениях. Затем обеззараживать дверь 70% этанола перед закрытием и запустить процесс обеззараживания. Система будет стерилизована ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут.
Для загрузки пластин с культурой среднего или диссоциации реагент, выполнить запустить HEPA капот шаг и открыть дверь жидкости обработки станции. После обеззараживания 70%-ным этанолом поместите резервуары на палубу в назначенное положение и снимите с них крышку. Закройте дверь жидкостной станции обработки, а затем запустите процесс ресурсного инструмента InitHepaHood, чтобы выть капот HEPA.
Чтобы выполнить автоматизированный метод культуры, в представлении календаря графического пользовательского интерфейса, нажмите добавить шаг процесса и выберите линию ячейки, которая будет использоваться в эксперименте. Используйте мастера, чтобы выбрать проект и отметить пакет, который будет использоваться. Нажмите на правую головку стрелки и перейдите на следующую страницу мастера, чтобы выбрать этап процесса, который будет выполнен.
На последней странице мастера запланируйте эксперимент и установите соответствующие параметры, детали переменные, необходимые для запуска метода. Тогда нажмите OK. После загрузки 50-миллилитровой трубки с подвеской клеток IPS человека, загрузите покрытые пластины культуры для получения клеток на полке и выполнить посев пластин из труб метод. Чтобы подсчитать клетки в цитометре изображения Брайтфилда, автоматически подготовьте 384-хорошо подсчитываемую пластину с подвеской клетки на палубе и используйте роботизированную руку для переноса 384-хорошо подсчитываемой пластины с палубы на цитометр изображения Брайтфилда.
После подсчета, система вернет пластину в исходное положение и перенесите культуру с покрытием или анализную пластину с полки на палубу труб. Система будет затем семян клеток в определяемых пользователем числа и объемов, пригодных для пластины и смешивать с помощью пипетки. После посева пластина будет перемещена в шейкер на палубе в течение 10 секунд при 500 оборотов в минуту для распределения клеток, прежде чем быть переданы в инкубатор двуокиси углерода.
Чтобы оценить автоматическое слияние, выполните метод проверки слияния и выберите партию, которая содержит по крайней мере одну культурную пластину и никаких анализных пластин. В разделе подробно параметров введите iPSCf_2020 для получения изображения в настройках анализа изображений. Затем система перенесите первую пластину из инкубатора в цитометр изображения Брайтфилда и изучат слияние клеток.
Чтобы изменить культуру клеток или продать пластины СМИ, выполнить медиа-изменение метода культуры пластин и выбрать партию, содержащую только культуры пластин. Система перенесите пластины на палубу и наклонит пластины, чтобы устремление супернатанта. Супернатант будет отброшен в модуль сбора отходов и отбросит наконечники и 12 миллилитров свежей среды будут добавлены к каждой пластине.
Затем система повторно закроет пластины и вернет пластины в инкубатор клеточной культуры. Кроме того, чтобы изменить среду анализа пластин, выполнить медиа-изменение метода анализа пластин. Чтобы субкультивировать клетки, выполните субкультивирование метода адептов клеток и выберите партию, содержащую культурные пластины, которые нуждаются в субкультивации.
После отбрасывания среды, система будет мыть клетки один раз с восемью миллилитров PBS на тарелку, прежде чем добавить восемь миллилитров 0,5 миллимолярной ЭДТА в клетки. После восьми минут на палубе с наклоном вариант, EDTA будет заменен на 12 миллилитров свежей среды на тарелку. Система будет трясти пластины на 2000 оборотов в минуту в течение одной минуты, чтобы выбить колоний до тритурации клеток с пятью циклами трубопроводов, чтобы разбить колонии на 50 до 80 микрон сгустки.
Клетки будут затем переданы в 50 миллилитров трубки на палубе, прежде чем посев их в один-семь раскол соотношение. Для автоматизированного высокого содержания, высокой пропускной способности клеточной визуализации, выполнить метод изображения и выбрать пакет, который содержит по крайней мере один анализ пластины и не культуры пластин. Затем система перенесите анализную пластину в автоматизированный конфокальный микроскоп для визуализации.
Не забудьте выбрать правильную партию и пластины IDs при выполнении необходимых этапов процесса. Культуры hiPSC должны контролироваться ежедневно для роста и анализироваться на их процент слияния в цитометре изображения Брайтфилда. После passaging и ручной или автоматизированной культуры системы, клетки exhibit типичная выражение стволовой клетки и плюрипотенции маркера.
Нейроны, дифференцированные в автоматизированной системе культуры, демонстрируют аналогичную организацию морфологии и нейрональной сети нейронам, культивируемым вручную. После шести дней дифференциации, автоматически дифференцированные корковые нейроны являются положительными для нейронов конкретного класса III бета-тубулин и верхний корковый слой маркера выражения. После восьми дней, клетки также выразили микротрубочек связанных белка 2, молекулы адгезии нервных клеток, и синапсина I, а также корковых маркеров нейронов.
Очень низкое или нет выражение этих маркеров наблюдается в hiPSC. Эта система также может быть использована для создания живой ячейки автоматизированных neurite нарастание анализ, который позволяет neurite длины должны быть измерены в течение 11 дней дифференциации без ручного вмешательства. Использование автоматизированной системы культуры для выполнения средних изменений в течение 65-дневного периода культуры облегчает дифференциацию hiPSC на среднебрайновые дофаминергические нейроны с ожидаемой клеточной организацией и морфологией.
В дополнение к neurite нарастание, другие автоматизированные фенотипические анализы, имеющие отношение к изучению нейродегенерации, например, TDP-43 транслокации РНК foci и альфа-синуклеин фибрилляции поглощения, могут быть изучены с помощью этой высокой пропускной способности, формат высокого содержания.
