Name: a cost effective and adaptable scratch migration assay
Uploaded: 2020-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי פרס המחקר הרפואי של צבא ארה"ב #81XWH-16-1-0710, בית הספר לרוקחות של אוניברסיטת מיסיסיפי והמחלקה למדעים ביו-מולקולריים.

1. תרבות תאים כללית
<ol><li>פיברובלסטים לבביים תרבותיים במדיום הנשרים המותאם (DMEM) של דולבקו המכילים 1 גרם/ל גלוקוז, נתרן פירובלט, L-גלוטמין, בתוספת עם 14.2 mM NaHCO3, 14.9 mM HEPES, 15% סרום חום לא פעיל של צופר עוברי (FBS), 2% L-גלוטמין, ו 0.02% מיקרוגנט מיקרוביאלי (ראה טבלת חומרים)ומתוחזק בחממה CO2...

<ol>
	<li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (1997).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nature Immunology. 6, (2005).</li><li>Yahata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Function+of+Angiotensin+II+in+Skin+Wound+Healing+Induction+of+Fibroblast+and+Keratinocyte+Migration+by+Angiotensin+II+via+Heparin-Binding+Epidermal+Growth+Factor+(EGF)-like+Growth+Factor-Mediated+EGF+Receptor+Transactivation.">A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Single-Cell+Migration.">Cell Migration Single-Cell Migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).</li><li>Brand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22+is+increased+in+active+Crohn's+disease+and+promotes+proinflammatory+gene+expression+and+intestinal+epithelial+cell+migration.">IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).</li><li>Chi, Z., Melendez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cell+Adhesion+Molecules+and+Immune-Cell+Migration+in+the+Initiation,+Onset+and+Development+of+Atherosclerosis.">Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 1 (4), 171-175 (2007).</li><li>Chen, H., Nalbantoglu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ring+cell+migration+assay+identifies+distinct+effects+of+extracellular+matrix+proteins+on+cancer+cell+migration.">Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration.</a> BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).</li><li>Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+alterations+in+cardiac+fibroblast+function+following+induction+of+pressure+overload.">Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload.</a> Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).</li><li>Darby, I. A., Laverdet, B., Bont&#233;, F., Desmouli&#232;re, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts+in+wound+healing.">Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing.</a> Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>Even-Ram, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+3D+matrix.">Cell migration in 3D matrix.</a> Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).</li><li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays.">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37, 208-215 (2005).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing:+An+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays.">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li><li>Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+dilution+impact+on+in+vitro+wound+healing:+Normoxic+and+hypoxic+condition.">Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).</li><li>Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+Mouse+3T3+Fibroblasts+in+Response+to+a+Serum+Factor.">Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).</li><li>Ascione, F., Guarino, A. M., Calabr&#242;, V., Guido, S., Caserta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+quantify+the+wound+closure+dynamic.">A novel approach to quantify the wound closure dynamic.</a> Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).</li><li>Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Diabetic+Conditions+and+AGE/RAGE+Signaling+on+Cardiac+Fibroblast+Migration.">The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).</li><li>Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+Cell+Migration+by+Substrate+Dimension.">Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension.</a> Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).</li></ol>

גישה חדשה זו לבחינת העברת השריטות מספקת שיטה נגישה יותר לחוקרים לבחון שינויים בהדברת תאים. בעוד הודעה זו פועלת על פי אותו הליך לניהול שריטה דומה למאגרים אחרים של שריטה, היא מספקת שיטה חדשה להדמיה וניתוח מדויק של העברת תאים10. במקום להשתמש בשיטות עתירות ציוד של מיקרוסקופית זמן-?...

העברת תאים היא חיונית עבור אירועים פיזיולוגיים רבים, כמו גם פתולוגיים. הוא נדרש במהלך הפיתוח, להרכבת תגובה חיסונית, ולריפויפצעים נאותים 1,2,3. רבים מאירועי העברת תאים אלה יכולים להיות מופעלים על ידי אותות פיזיקליים או כימיים. לדוגמה, במהלך תגובה חיסונית, leukocytes לנדדו לעבר אתר של פציעה בתגובה כימותרפיה2. בנוסף, leukocytes גם לשחרר ציטוקינות כדי לגרום הגירה של תאים חיסוניים נוספים, כמו גם סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים, אשר מעורבים בתהליך ריפוי הפצע, ובכך, ייזום תגובה רבתאית 4. היכולת של תאים לנדוד חיונית לתפקוד פיזיולוגי תקין; עם זאת, כאשר נדידת תאים עוברת ללא בדיקה, זה יכול להיות תגובה שלילית ולתרום לאירועים פתולוגיים, כגון דלקת כרונית, מחלת כלי דם, גרורות סרטן, וריפוי פצעלקוי 2,3,4,5,6,7. ריפוי פצעים לקויים הוא סבל נפוץ של חולי סוכרת עקב פגמים בנדידה לתאים, ואם פגמים אלה אינם מטופלים, זה יכול להוביל לסיבוכים נוספים (למשל,קטיעה 8,9). מחקר זה, כמו גם אחרים, הצביעו על הצורך להבין עוד יותר את התהליך שבו מתרחשת נדידת תאים, בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים רגילים, והוא חיוני גם להם לאורך תחום מחקר זה. כדי להשיג זאת, צריך להיות הגירה זמין כי הם נגישים ובמחיר סביר עבור אותם חוקרים, מי לא יכול להיות בעל הציוד הדרוש כדי לנהל את ההתאסות האלה.
נכון לכך, קיימים מגוון של העברות הזמינות לבחינת מגוון רחב של נושאים הנוגעים להעברה של תאים. פותחו מודלים של העברה תלת-מיתית ותלת-מיוד, שכל אחד מהם מתמקד באזורים ספציפיים המשפיעים על העברת תאים. מודלים נדידת 3D קשורים בדרך כלל מחקרים פלישת תאים ולהעריך את ההשפעה של מטריצהחוץ תאיתעל נדידת תאים 10,11,12, בעוד 2D הגירה יש מגוון גדול יותר של יישום והם משמשים בעיקר כדי ללמוד הגירה chemotactic, ריפוי פצעים, ושינויים פונקציונלייםבמהלך נדידת תאים 13,14,15,16. חלק מהאסמים הללו דורשים ציוד נוסף, כגון תאי ביידן או טבעות הדרה, מה שיכול להפחית את הזמינות של בדיקות אלה לחוקרים מסוימים. אחד האברים חסכוניים יותר הוא אחסון השריטות, המשמש בדרך כלל להערכת ריפוי פצעים ושינויים כללייםבהדחת תאים 14,17. בעוד רוב המעבדות מצוידות לנהל אחסון שריטה, הציוד המשמש למעקב אחר העברת תאים נוטים להיות גם לא זמין או יקר מדי לרכישה. זה כולל מיקרוסקופ זמן לשגות, אשר דורש מיקרוסקופ הפוך ומערכת הדמיה חיה. פריטי ציוד יקרים אלה אינם נגישים בדרך כלל לכל מעבדה. לכן, תצפית זו מדגישה את הצורך בפרוטוקול חדש המאפשר הערכה של העברת תאים עם ציוד זמין יותר.
הפרוטוקול המוצג כאן מספק דרך חדשה ובמחיר סביר להעריך את העברת התאים. שיטה זו פועלת על פי אותו הליך המשויך לבדיקות שריטה אך שונה בניתוח של בדיקת העברת תאים על-ידי שימוש בציוד הזמין בדרך כלל בהגדרת מעבדה בסיסית במדעים. פרוטוקול זה באמצעות ציוד משותף מאפשר קביעה מדויקת יותר של העברת תאים ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף לקביעת ההעברה, שיטה זו מהווה גם גורמים משתנים באזור השריטה אשר הונו להשפיע מאוד על העברת תאים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה לניתוח העברת תאים מספק הזדמנות למעבדות נוספות לחקור ולתרום לתחום העברת התאים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe All Apps</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>AVR1</td>
			<td>Tips are autoclaved to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam Erc 5s Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>426540-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP101-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10014CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC416785000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium US origin fetal bovine serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IFBS-HU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGEN</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td>This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Primovert Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>491206-0002-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue Edition 2.3 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>software comes with camera purchase</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cost effective and adaptable scratch migration assay

העברת תאים היא מרכיב מרכזי הן באירועים פיזיולוגיים והן באירועים פתולוגיים. העברת תאים רגילה נדרשת עבור פונקציות חיוניות כגון פיתוח והרכבה של תגובה חיסונית. כאשר מתרחש פגם או שינוי עם תהליך העברת התא, זה יכול להיות תוצאות מזיקות (כלומר, גרורות סרטן, ריפוי הפצע, היווצרות צלקת). בשל החשיבות של העברת תאים, יש צורך בגישה להעברה סלולרית, הניתנת להתאמה ותוכלית לחזרה. תוך שימוש בהגידת השריטות הנפוצה, פיתחנו גישה חדשה לניתוח נדידת תאים המשתמשת בציוד מעבדה כללי. השיטה המתוארת משתמשת בסמנים חזותיים המאפשרים לכידת אזורים מסוימים בעלי עניין ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף, היא מספקת גמישות בעיצוב הניסיוני, החל משינוי המטריצת הנדידה ועד לתוספת של משנה תרופתי. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר דרך לתת דין וחשבון על האזור של העברת תאים, אשר אינו נחשב על-ידי מספר שיטות בעת בדיקת העברת תאים. גישה חדשה זו מציעה אסיא הגירה שריטה לקהל גדול יותר ותספק הזדמנות גדולה יותר לחוקרים לבחון את ההשפעה הפיזיולוגית והפתופיזיולוגית של העברת תאים.

הליך זה מתעד גישה חדשה לחקר העברת תאים שהיא גם חסכונית וגם ניתנת להתאמה עבור רוב המעבדות. מחקרים רבים השתמשו במיקרוסקופ זמן לשגות כדי להעריך את העברת תאים, אבל הציוד הדרוש לשיטה זו אינו זמין בקלות למעבדות רבות. בעוד ניצול קווים ומקפים לתיכור מאפשר את היכולת ללכוד מחדש תחומי עניין ספציפיים ...

Watch this Scientific Journal Video about A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay at JoVE.com

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לטכניקה ישנה, והוא יספק גישה חדשה עבור מספר רב של חוקרי מדע בסיסיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הטבע חסכוני שלה, כמו גם הסתגלות שלה כדי לשמש קהל מדעי רחב יותר. כדי להכין צלחת הגירה, השתמש בסמן קבוע בצבע בהיר כדי למתוח קו לאורך מרכז החלק האחורי של כל באר של צלחת 48 באר ולצייר שלושה סימני Hash לחלק כל באר לשלושה תחומי עניין נפרדים.ואז צלחת 1.5 עד פעמיים 10 למעבר הרביעי fibroblasts לב לתוך כל באר ותרבות התאים בתנאי תרבות נורמלית במשך 24 עד 48 שעות עד שהם מגיעים 90 עד 95% confluency. כאשר התאים מוכנים, להסיר את supernatant מכל באר ולהשתמש קצה פיפטה P200 סטרילי כדי להפוך אחד לעבור שריטה לאורך הקווים המצויר. לשטוף את בארות עם מדיום סרום נמוך כדי להסיר את כל fibroblasts לב מחובר ולהוסיף 500 microliters של בינוני סרום נמוך לכל באר.אם נעשה שימוש בסוכנים תרופתיים, הוסף את הסוכנים ל בארות המתאימות. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך עם מטרה של 20x כדי ללכוד שתי תמונות של אפס שעות ל הבאר באמצעות הסימונים כדי למקם כל באר כדי לאפשר הדמיה של החצי העליון של הקו שרוט. לאחר מכן להזיז את הצלחת כדי למקם את החצי התחתון של הקו שרוט לתוך התצוגה כדי לאסוף את התמונה השנייה ולמקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם PVS לא סטרילי ולהוסיף 500 microliters של 4% paraformaldehyde לכל באר במכסה המנוע אדים. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף כל טוב שלוש פעמים PBS טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל את התאים עם 300 microliters של פתרון permeabilizing לגם נדנדה עדינה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, החליפו את הפתרון המחלחל בכתם כחול מבריק של 1% קומאסי למשך 10 דקות דגירה עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. ואחריו שלוש, חמש דקות שוטף PBS עם נדנדה. לאחר הכביסה האחרונה, להוסיף 300 microliters של PBS לכל באר בזהירות למקם את הצלחת באותו מיקום כמו עבור תמונת שעת האפס לפני לכידת שתי תמונות 24 שעות ביממה לכל גם הפגינו.בסוף הניסוי, פתח את התמונות ותוכנת ניתוח הדמיה מתאימה וצור שכבה חדשה על תמונת שעת האפס. לחצו פעמיים לשינוי שם שכבת קו השכבה החדשה ובחרו בכלי המברשת. שנה את גודל הפיקסל ל- 10 ואת הצבע לאדום וצייר שני קווים נפרדים כדי לחלק את הטיוטה לרמות.הקווים אינם יכולים לגעת בתאים כלשהם. פתחו את התמונה 24 שעות ביממה בתוכנת ההדמיה ובחרו בכלי ההזזה. החזקת לחצן הבקרה לחוץ, לחץ הן על הקווים והן על שכבות הרקע, לחץ במרכז תמונת שעת האפס וגרור את שתי השכבות לאמצע התמונה של 24 שעות.בתדמית של 24 שעות, לחץ על שכבת הרקע של אפס שעות ושנה את האטימות ל- 50%החזקת לחצן הבקרה, לחץ הן על רקע שעת האפס והן על שכבות הקו ולחץ על עריכה ושינוי צורה חופשי כדי לשנות את השכבות באמצעות המרה חופשית, ישר את רקע אפס השעה ותמונות קו לתדמית הרקע של 24 שעות כך שקווי העברת האזור ימקמו כראוי בתדמית של 24 שעות. כששכבת הקו מכוסה בהצלחה, לחצו לחיצה ימנית למחיקת שכבת הרקע של שעת האפס. ניתן להשתמש בשכבת השורה הנותרת כדי לקבוע את מספר התאים שהועברו לאזור האחסון הטיוטה במשך 24 שעות.לאחר מכן שמרו את תמונת ההעברה החדשה הן כ- Photoshop והן כקובץ TIFF או JPEG. כדי לכמת את מספר התאים הנודדים, פתח את תמונת ההעברה ואת התוכנית המקבלת קבצי TIFF או JPEG וספירה ידנית של מספר התאים הממוקמים בין לבין ונוגע בשני הקווים האדומים עבור שתי התמונות עבור כל באר. לאחר מכן רשום את מספר התאים הנודדים לתמונה.כדי לקבוע את אזור ההעברה, פתח את התמונה 24 שעות ביממה המכילה את קווי ההעברה בתוכנת ההדמיה ושמור את התמונה כתדמית אזור העברה. לאחר השמירה, לחצו על שכבת הרקע ולחצו לחיצה ימנית למחיקת השכבה. השתמש בכלי המברשת כדי למלא את האזור שבין קווי האחסון, באותו צבע ששימש את הקווים ולחץ על סרגל תמונה, מצב ואפור כדי לשנות את התמונה לשחור-לבן.שמור את התמונה ופתח את תמונת אזור ההעברה ותוכנית מתאימה לניתוח תמונה. לחץ על ערוך והתהפך. כדי לקבוע את אזור קו ההעברה, לחץ על תמונה, התאם סף.אזור ההעברה השחורה יהפוך לאדום ואזור האחוזים יצוין בתיבת הסף. לאחר מכן רשום את אזור האחוזים עבור שורת ההעברה ואשר שערך זה משויך למספר התאים הנודדים עבור אותה תמונה. בניתוח זה, 46 פיברובלסטים מלבבות שאינם סוכרתיים ו -129 פיברובלסטים מלבבות סוכרתיים היגרו במהלך תקופת הזמן הניסיונית של 24 שעות.מדידת אזור ההגירה כפי שהוכח, העלתה כי אזור השריטה הלא סוכרתי היווה 24.78% מכלל השטח שנמדד, בעוד שאזור השריטה של ההגירה הסוכרתית היווה 16.77% מכלל השטח שנמדד. נרמול לתחום ההגירה מספק הערכה טובה וקפדנית יותר של הגירת תאים ושלל טעות אנוש פוטנציאלית. לדוגמה, אם רק מושווים מספר הפיברובלסטים שהועברו, נראה בניתוח זה שמספר התאים שהיגרו באר זו היה כפול מזה של התאים שהועברו באר השנייה.עם זאת, כאשר נעשה שימוש באזור השריטה כדי לנרמל את הנתונים, היחס בין הפיברובלסטים לאזור הנדידה נצפה כמעט זהה בשתי בארות. הקפד ללכוד מחדש את אזור ההעברה בתמונה של 24 שעות, כפי שלכדת בתדמית של שעת האפס. בעקבות הליך זה, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע כדי לבחון ביטוי חלבון בתוך התאים.אנו מאמינים כי גישה חדשה יותר זו להעברת השריטות תאפשר לפתוח אפיקים נוספים של מחקר מדעי שלא היו זמינים בעבר.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

At-Risk Butterfly Captive Propagation Programs to Enhance Life History Knowledge and Effective Ex Situ Conservation Techniques

בסיכון בשבי פרפר תוכניות התפשטות כדי לשפר את ההיסטוריה החיים ידע ויעיל לשעבר שימור באתרו טכניקות

Improving knowledge of ex situ best practices for at-risk butterflies is important for generating successful conservation and recovery program outcomes. ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

השתלת שתיל מדרגית, גמישה וחסכונית

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...