Name: planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing
Uploaded: 2020-07-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing at JoVE.com

يشكر المؤلفون السيد تابان غول على تعليقاته على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل NSF منحة الوظيفي 1555109.

1. كمية تحليل السلوك ا
<ol><li>الإعداد التجريبي<ol><li>ضع لوحة LED قابلة للتهياء على سطح مستو. تخدم لوحة LED غرضين: (1) لتوفير خلفية بيضاء موحدة و (2) لاستخدامها كمصدر للضوء قابل للتعديل للحصول على التباين المناسب. ضع ساحة طبق بيتري مقاس 100 مم على لوحة LED. ملاحظة: لزيادة الإنتاجية، يمكن استخدام لوحة متع...

<ol>
	<li>Rink, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+systems+and+regeneration+in+planaria.">Stem cell systems and regeneration in planaria.</a> Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).</li><li>Reddien, P. W., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Planarian+Regeneration.">Fundamentals of Planarian Regeneration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+central+nervous+system:+how+easy+for+planarians.">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians.</a> Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).</li><li>Pearl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memoirs:+The+Movements+and+Reactions+of+Fresh-Water+Planarians:+A+Study+in+Animal+Behaviour.">Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour.</a> Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).</li><li>Mc Connell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).</li><li>Talbot, J., Sch&#246;tz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+planarian+wild-type+behavior+as+a+platform+for+screening+locomotion+phenotypes.">Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes.</a> Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).</li><li>Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrunching:+a+novel+escape+gait+in+planarians.">Scrunching: a novel escape gait in planarians.</a> Physical Biology. 12, 055001 (2015).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+shows+decision-making+behavior+in+response+to+multiple+stimuli+by+integrative+brain+function.">Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function.</a> Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).</li><li>Arenas, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+planarian+TRPA1+by+reactive+oxygen+species+reveals+a+conserved+mechanism+for+animal+nociception.">Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception.</a> Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).</li><li>Shomrat, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+training+paradigm+reveals+long-term+memory+in+planarians+and+its+persistence+through+head+regeneration.">An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration.</a> Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Second-Generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+Molecularly-Tractable+model+organisms.">A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms.</a> PLoS One. 5, 1-20 (2010).</li><li>Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system+development+and+regeneration+in+freshwater+planarians.">Nervous system development and regeneration in freshwater planarians.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).</li><li>Cebri&#224;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+neural-specific+genes+reveals+the+structural+and+molecular+complexity+of+the+planarian+central+nervous+system.">The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system.</a> Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).</li><li>Mineta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs.">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).</li><li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SoxB1+Activity+Regulates+Sensory+Neuron+Regeneration,+Maintenance,+and+Function+in+Planarians.">SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians.</a> Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+Dopaminergic+Neural+Network+and+Locomotion+Function+in+Planarian+Regenerates.">Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).</li><li>Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+planarian+TRPA1+homolog+mediates+extraocular+behavioral+responses+to+near-ultraviolet+light.">The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).</li><li>Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sources+of+hedgehog+modulate+neurogenesis+in+the+adult+planarian+brain.">Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smed-dynA-1+is+a+planarian+nervous+system+specific+dynamin+1+homolog+required+for+normal+locomotion.">Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion.</a> Biology Open. , 1-8 (2014).</li><li>Currie, K. W., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+lhx1/5-1+and+pitx+are+required+for+the+maintenance+and+regeneration+of+serotonergic+neurons+in+planarians.">Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians.</a> Development. 140, 3577-3588 (2013).</li><li>Hagstrom, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+cholinesterase:+molecular+and+functional+characterization+of+an+evolutionarily+ancient+enzyme+to+study+organophosphorus+pesticide+toxicity.">Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity.</a> Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).</li><li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+brain+regeneration+as+a+model+system+for+developmental+neurotoxicology.">Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology.</a> Regeneration. 3, 65-77 (2016).</li><li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+planarians+as+an+alternative+animal+model+for+neurotoxicology.">Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology.</a> Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).</li><li>Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-behavioral+endpoint+testing+of+an+87-chemical+compound+library+in+freshwater+planarians.">Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians.</a> Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).</li><li>Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+neurotoxic+potential+of+15+flame+retardants+using+freshwater+planarians.">Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians.</a> Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).</li><li>Wu, J. P., Li, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+freshwater+planarians+in+environmental+toxicology+studies:+Advantages+and+potential.">The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).</li><li>Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+assembly+and+function+in+planaria.">Analysis of ciliary assembly and function in planaria.</a> Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).</li><li>Sabry, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+or+genetic+targeting+of+Transient+Receptor+Potential+(TRP)+channels+can+disrupt+the+planarian+escape+response.">Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response.</a> PLoS One. , 753244 (2019).</li><li>Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slo1+regulates+ethanol-induced+scrunching+in+freshwater+planarians.">Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians.</a> Physical Biology. 13, 1-12 (2016).</li><li>Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+zebrafish+and+planarian+model+systems+for+developmental+neurotoxicity+screens+using+an+87-compound+library.">Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library.</a> Toxicological Sciences. , (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Behaviors+and+Wall-Curvature+Lead+to+Apparent+Wall+Preference+in+Planarian.">Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian.</a> PLoS One. 10, 0142214 (2015).</li><li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength.">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9, 114708 (2014).</li><li>Petrus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+TRPA1+in+mechanical+hyperalgesia+is+revealed+by+pharmacological+inhibition.">A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition.</a> Molecular Pain. 3, 40 (2007).</li><li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-dependent+conditional+gene+knockdown+(Readyknock)+in+planarian:+Demonstration+of+requirement+for+Djsnap-25+expression+in+the+brain+for+negative+phototactic+behavior.">Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 49, 383-394 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergic+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica.">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).</li><li>Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosensory+signaling+by+TRPM+is+processed+by+brain+serotonergic+neurons+to+produce+planarian+thermotaxis.">Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).</li></ol>

باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن دراسة كمية آثار المحفزات الفيزيائية والكيميائية7،,28،,29 أو التلاعب الجيني (RNAi)28،29 على الحركة بلاناري. لتحقيق أقصى قدر من الدقة المكانية، فمن الأفضل لنقل الكاميرا أقرب...

بالإضافة إلى شعبيتها لابحاث الخلايا الجذعية وتجديد1,2,3, وقد استخدمت منذ فترة طويلة في الدراسات السلوكية4,5,الاستفادة من حجمها الكبير نسبيا (بضعة ملليمترات في الطول), سهولة وانخفاض تكلفة صيانة المختبر, وطيف واسع من السلوكيات الملاحظة. وقد مكنت مقدمة من رؤية الكمبيوتر وتتبع الآلي لدراسات السلوك6،7،8،9،10،11 التمايز الكمي من الأنماط الظاهرية السلوكية. سلوك الحيوان هو قراءات مباشرة من وظيفة الخلايا العصبية. لأن الجهاز العصبي غير المتوسط الحجم والتعقيد، ولكن أسهم العناصر الأساسية المحفوظة مع الدماغ الفقارية12،13،14، يمكن لدراسة السلوك بلانيوار توفير نظرة ثاقبة آليات الحفاظ على العمل العصبي الذي قد يكون من الصعب التحقيق مباشرة في الكائنات الحية أكثر تعقيدا. وهكذا، فإن البوليين نموذج قيم للدراسات البيولوجية العصبية المقارنة8،12،15،16،17،18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك، تسمح البيئة المائية بالتعرض السريع والواه للمواد الكيميائية لدراسة تأثيرها على وظيفة المخ في التجديد و 26 من الكائنات الخبيثة في مجال تجديد الخلايا السنية، مما يجعلها نظامًا شائعًا في علم السموم العصبية22،23،24،25،26.
يمتلك المواحنون ثلاث مشيات متميزة ، يشار إليها باسم الانزلاق ، وال peristalsis ، وscrunching. كل مشية يتم عرضها في ظروف محددة: مزلق هو مشية الافتراضي, peristalsis يحدث عندما يتم اختراق وظيفة ciliary7,27, وscrunching هو مشية الهروب – مستقلة عن وظيفة أهداب – ردا على بعض المحفزات الضارة7. لقد أظهرنا أن scrunching هو استجابة محددة ، التي أثارها الإحساس ببعض الإشارات الكيميائية أو الفيزيائية ، بما في ذلك درجات الحرارة القصوى أو درجة الحرارة ، والإصابة الميكانيكية ، أو محرضات كيميائية محددة ، وبالتالي ليست استجابة عامة للإجهاد7،28،29.
بسبب خصوصيته والمعلمات النمطية، والتي يمكن بسهولة كميا باستخدام هذا البروتوكول، scrunching هو نمط ظاهري السلوكية القوية التي تمكن الباحثين من إجراء دراسات ميكانيكية تشريح المسارات الحسية والسيطرة العصبية من السلوك25،28. بالإضافة إلى ذلك ، وقد تبين أن scrunching نقطة نهاية حساسة لمجرا الآثار الكيميائية الضارة على تطوير الجهاز العصبي وظيفة في دراسات السمومالعصبية 22،24،25،30. كما يبدو عدة مسارات حسية مختلفة للالتقاء للحث على scrunching من خلال آليات مختلفة28, scrunching يختلف عن السلوكيات الأخرى االحلاني لأن مختلف, ولكن محددة, يمكن استخدام المحفزات لتشريح الدوائر العصبية متميزة ودراسة كيفية دمج إشارات مختلفة لإنتاج النمط الظاهري scrunching.
والأهم من ذلك، توجد اختلافات في الأنواع، حيث قد تثير مادة كيميائية واحدة التشوّر في نوع واحد من الأنواع القارّة، ولكن استجابة سلوكية مختلفة في نوع آخر. على سبيل المثال، وجدنا أن anandamide يحفز scrunching في الأنواع بلانكاري Dugesia japonica ولكن يدفع peristalsis في شميدتيا mediterranea28. يسلط هذا المثال الضوء على أهمية القدرة على التمييز بشكل موثوق بين المشي المختلفة ، لأنها هي المظاهر الظاهرية للآليات الجزيئية المتميزة. ومع ذلك ، فإن التمييز بين الزخرف من ال peristalsis صعب استخدام بيانات الرصد النوعي ، لأن كلا المشية يحركها العضلات وتشترك في أوجه التشابه النوعي7،28. وهكذا، للتمييز بين المشي فمن الضروري إجراء التصوير أهداب أو دراسة سلوكية كمية، والتي تسمح التمييز على أساس المعلمات المميزة7،,28. لأن التصوير أهداب تحديا تجريبيا ويتطلب معدات متخصصة مثل المجهر المركب عالية التكبير وكاميرا عالية السرعة7,28, فإنه ليس في متناول الباحثين على نطاق واسع كما التحليل السلوكي الكمي.
هنا، نقدم بروتوكول لـ (1) تحريض scrunching باستخدام مختلف المادية (درجة الحرارة الضارة، بتر، الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة) والكيميائية (الأليل isothiocyanate (AITC)، cinnamaldehyde) المحفزات و (2) التحليل الكمي للسلوك البلاناري باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية. من خلال قياس أربعة معلمات (تردد تذبذبات طول الجسم ، والسرعة النسبية ، والحد الأقصى للسعة ، وعدم التماثل في اطالة الجسم والانكماش)7، يمكن تمييز scrunching عن الانزلاق ، وال peristalsis ، والدول السلوكية الأخرى المبلغ عنها في الأدب ، مثل التزحلق الشبيه بالثعبان15 أو الصرع15. وعلاوة على ذلك، في حين يتم حفظ scrunching بين الأنواع المختلفة7،كل نوع له ترددها وسرعتها المميزة الخاصة بها. لذلك، مرة واحدة تم تحديد السرعات مزلق وscrunching من الأنواع، يمكن استخدام السرعة وحدها كوسيلة للتمييز scrunching من الانزلاق وsing29. لا يفترض البروتوكول أي تدريب مسبق على تحليل الصور الحسابية أو الدراسات السلوكية وبالتالي يمكن تطبيقها أيضًا على التجارب السلوكية التخطيطية في سياق مختبري تعليمي على مستوى البكالوريوس. وتقدم بيانات المثال لتيسير تكييف البروتوكول في المادة التكميلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>377430-5G</td>
			<td>CAUTION:&#160; Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens, 2/3 25mm F/1.4&#160;</td>
			<td>Tamron</td>
			<td>23FM25SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile</td>
			<td>MedSupply Partners</td>
			<td>62-1019-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cinnamaldehyde, &#62;95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W228613-100G-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimmable A4 LED Tracer Light Box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HD631RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flea3 USB3 camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FL3-U3-13E4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-394-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td>Prepare in deionized water at 0.5 g/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montj&#252;ic salts, prepared in Milli-Q water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 20-200 &#956;L range</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17008652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 150 mL beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, 0.22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Golden Amber</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R21</td>
			<td>Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Medium Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Storaro Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco transfer pipette, 62 &#181;L large aperture</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>691TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support stand&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-947-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser pointer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B082DGS86R</td>
			<td>This is a Class II laser (405nm &#177;10nm) with output power &#60;5 mW.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing

تنزلق عادة ً ألواح المياه العذبة بسلاسة من خلال الدفع الإستهوي على جانبها البطني. ومع ذلك، يمكن أن تحفز بعض الظروف البيئية أشكال الحركة التي يحركها العضلات: التملق أو التحلل. بينما ينتج ال peristalsis عن عيب ciliary، scrunching مستقل عن وظيفة أهداب وهو استجابة محددة لبعض المحفزات، بما في ذلك بتر، درجة الحرارة الضارة، درجة الحرارة القصوى، والإيثانول. وهكذا، فإن هاتين المشيتين اللتين يحركهما الالعضلات متميزة بشكل ميكانيكي. ومع ذلك، قد يكون من الصعب التمييز بين نوعي. هنا، ونحن نقدم بروتوكولا لتحفيز scrunching باستخدام مختلف المحفزات الفيزيائية والكيميائية. نحن تفاصيل التوصيف الكمي من scrunching، والتي يمكن استخدامها لتمييزه عن ال peristalsis وتزلق، وذلك باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية. منذ scrunching هو مشية شاملة بلاناية، وإن كان مع اختلافات مميزة الأنواع محددة، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع لجميع أنواع من planarians، عند استخدام الاعتبارات المناسبة. لإثبات ذلك، قارنا استجابة النوعين الأكثر شعبية في البحوث السلوكية، دوديسيا جابونيكا وميتميديرانيا، إلى نفس المجموعة من المحفزات الفيزيائية والكيميائية. وعلاوة على ذلك، فإن خصوصية scrunching يسمح هذا البروتوكول لاستخدامها جنبا إلى جنب مع تدخل الحمض النووي الريبي و / أو التعرض الدوائية لتشريح الأهداف الجزيئية والدوائر العصبية المعنية، مما يحتمل أن يوفر رؤية ميكانيكية في الجوانب الهامة من nociception والاتصالات العصبية العضلية.

خارج أشعة فوق البنفسجية التصور في S. mediterranea planarians TRPA1 تعتمد وقد اقترح أن تكون مرتبطة H2O2 الافراج17. لأن التعرض H2O2 يحفز TRPA1 تعتمد على scrunching في S. mediterranea وD. japonica planarians28، يمكن استخدام الخطوات في القسم 2.1.4 لاختبار ما إذا كان التعرض للض...

Watch this Scientific Journal Video about Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing at JoVE.com

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

يحمل المُعَلِّقون في المياه العذبة ثلاث مشيات (مزلق، و peristalsis، وscrunching) يمكن تمييزها من خلال التحليل السلوكي الكمي. نحن وصف طريقة للحث على scrunching باستخدام مختلف المحفزات الضارة، وتحديد كم من ذلك، والتمييز من ال peristalsis وتزلق. باستخدام ضرب الجينات ، ونحن نبين خصوصية scrunching كمي phenotypic القراءة.

بلانكوري Scrunching كما قراءات سلوكية كمية لتحسس المحفزات الضارة

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتوضيح السلوك الطريولوجي وآليات ثانية ثانية الكامنة في هذا السلوك من خلال الجمع بين التحليل السلوكي الكمي مع الاحتياجات الجزيئية والكيميائية. هذه التقنية يمكن الوصول إليها بسهولة لجميع مستويات المهارة لأنها لا تتطلب أدوات متقدمة أو برامج متخصصة للحصول على قراءات سلوكية كمية من اخصاريين متحركين. يمكن استخدام Scrunching لدراسة الاستثناء في الـ planarians ، ويعمل بمثابة نقطة نهاية حساسة للتشذيب ، مما يعطل وظيفة الجهاز العصبي الناجم عن Xenobiotics والمرض.ابدأ بوضع لوحة LED قابلة للإضاءة على سطح مستوٍ، والذي سيوفر خلفية بيضاء موحدة ويمكن استخدامه كمصدر للضوء قابل للتعديل للحصول على التباين المناسب. وضع 100 ملليمتر ساحة طبق بيتري على لوحة LED. قم بتركيب كاميرا على حامل حلقة فوق الحلبة وضبط موقعها وارتفاعها وتركيزها عند الضرورة بحيث تتركز الساحة بأكملها في مجال الرؤية وهي في بؤرة التركيز.املأ الساحة بحوالي 25 ملليلتر من وسائط التعرض المناسبة للحصول على أقصى حجم، قم بتشغيل لوحة LED وإيقاف أي مصادر ضوئية أخرى قد تؤثر سلبًا على جودة التسجيل. إسقاط بلانكاري في وسط الساحة باستخدام ماشيت نقل. عند اختبار محلول كيميائي، نقل المايناري مع أقل قدر ممكن من المياه غير المُطرية، بحيث لا يتم تغيير تركيز المادة الكيميائية بشكل كبير.ابدأ تسجيل البيانات كتسلسلات صور بتنسيق فيجي الأصلي. بالنسبة للتجارب المزلقة ، سجل دقيقة إلى دقيقتين من سلوك الانزلاق ، لتجارب الزلق أو ال peristalsis ، سجل فترة كافية لالتقاط ما لا يقل عن ثلاثة تذبذبات متتالية تحدث في خط مستقيم. بمجرد الانتهاء من التجربة، قم بإنهاء التسجيل.إذا وصل الم planarian إلى حدود الساحة دون تلبية معيار الإنهاء ، فإن الماصة تعود إلى مركز الساحة. افتح تسلسل الصورة الخام لتجربة في فيجي، وحولها إلى ثمانية بتات واستخدم أداة السهم أو شريط التمرير في الجزء السفلي من كومة الصور للتحريك عبر تسلسل الصورة. لاستخراج فترة زمنية ومنطقة ذات أهمية، رسم منطقة ذات فائدة تشمل المسار الكامل لـ planarian باستخدام أداة المستطيل.انقر بزر الماوس الأيمن على كومة الصورة وحدد مكررة، والتحقق من مربع حيث مكدس مكررة. أدخل الإطارات الأولى والأخيرة من تسلسل الاهتمام وانقر فوق "موافق". بالنسبة لتجارب الانزلاق، استخرج فترة من الانزلاق حيث يتحرك المُنطَرِي على الأقل ضعف طول جسمه لإجراء تجارب الزمر أو الزَّق.استخراج مثيل عندما يخضع لا يقل عن تذبذب الجسم على التوالي ثلاثة على التوالي وكاملة في خط مستقيم. تطبيق عتبة على كومة الصورة المكررة لbinarize الصورة واستخراج من الخلفية، وضبط أشرطة انزلاق بحيث يتم تمييز بلاناريان كامل باللون الأحمر. تعتمد القيم الدقيقة على جودة التصوير.اترك المربعات لخلفية داكنة، وكومة مدرج التكراري وعدم إعادة تعيين نطاق دون رادع. قم بالتمرير عبر مكدس الصور لضمان نطاق عتبة جيد ثم انقر فوق تطبيق. في تحويل المكدس إلى إطار ثنائي، تعيين الأسلوب إلى الافتراضي والخلفية إلى الضوء.قم بإلغاء تحديد كافة المربعات في هذه النافذة ثم انقر فوق "موافق". ستظهر صورة مُتَنَكَّلة تُظهر بلانياري أسود على خلفية بيضاء. تأكد من أن planarian كامل مرئيا في جميع إطارات تسلسل الصورة.تعيين القياسات بالنقر فوق تحليل و تعيين القياسات. حدد المربعات لتحديد المنطقة، مركز الكتلة، وضع المكدس وتناسب القطع الناقص، ثم انقر فوق Okay. حدد كومة الصورة المفتوحة وحدد تحليل، وتحليل الجسيمات.في إطار تحليل الجسيمات، حدد إظهار وأقنعة لفتح مكدس جديد يعرض كافة الكائنات التي تم اكتشافها باستخدام المعلمات المختارة. تعيين مرشح حجم لإزالة الضوضاء غير المرغوب فيها عن طريق إدخال المنطقة التقريبية من ا. ا. ثم حدد المربعات لعرض النتائج ومسح النتائج وانقر فوق "موافق".حرك خلال كومة صورة القناع باستخدام شريط التمرير في الجزء السفلي من اللوحة للتأكد من عدم وجود ضوضاء أو إطارات بدون بلانكاري. في نافذة النتائج، احفظ البيانات باستخدام الملف واحفظ باسم، أضف ملحق CSV إلى اسم الملف، لحفظ البيانات كقيم مفصولة بفواصل. بمجرد حفظ البيانات الخاصة بكدسة الصور، أغلق نتائج مكدس الصور والنوافذ القناع.للحث على scrunching عبر درجة الحرارة الضارة، والحرارة المياه البلاونية في كوب زجاجي إلى 65 درجة مئوية على لوحة ساخنة. وضع بلاناري في وسط الساحة، وانتظر حتى توجه نفسها تستقيم ويبدأ مزلق، ثم تبدأ التسجيل. استخدام P 200 ماصة إلى ببطء وباستمرار ماصة 100 ميكرولترات من المياه البلانارية المسخاة، بعد البلعوم على نهاية الذيل من البلاناري للحث على scrunching.إيقاف التسجيل، بمجرد توقف scrunching. وضع planarian في وعاء الانتعاش وتبادل وسائل الإعلام في طبق بيتري مع المياه النقية درجة حرارة الغرفة بلاناري، إذا تشغيل المزيد من التجارب. للحث على scrunching عن طريق البتر، ونقل بلاناريان إلى وسط الساحة والانتظار حتى يوجه نفسه منتصبا ويبدأ مزلق.ثم ابدأ التسجيل ، وبتر بلاناي بشفرة حلاقة نظيفة. التأكد من أن موقع القطع متناسق عبر التجارب. وقف التسجيل مرة واحدة في الجزء الأمامي قد توقفت scrunching.إزالة كل قطعة، ووضعها في حاوية منفصلة والسماح لهم لتجديد لمدة سبعة أيام. يمكن إعادة دمج المبترتين في حاوية المنزل بمجرد تجديدهم. تم استخدام هذا البروتوكول لاختبار ما إذا كان بالقرب من التعرض للضوء فوق البنفسجية ، ويحفز scrunching في S.mediterranea وD.japonica planarians ، في حين D.japonica planarians scrunch ، عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية القريبة ، S.mediterranea planarians إما أن يعرض ترقق الذيل أو لا استجابة.و quanting من المعلمات scrunching لD.japonica planarians التي عرضت ما لا يقل عن ثلاثة متتالية خط مستقيم scrunches، ويكشف عن خصائص المعلمات scrunching لهذا النوع في التعرض على النقيض من 250 cinnamaldehyde غير معروف TRPA ناهض واحد في الفئران، ويسبب scrunching وS.mediterranea. في حين أن يانيات D.japonica عرض خليط من مثل الثعابين والحركة المتذبذبة توقف من قبل مزلق أو رئيس قوي يتحول. وأسفرت عملية تحديد كمي للعينات التي لديها ثلاث ذبذبات متتالية على الأقل، عن قيم أقل بكثير بالنسبة لثلاثة من أصل أربعة بارامترات متوقعة بعد ذلك للتكشير في D.japonica، مما يشير إلى أن الحركة المتذبذبة الملاحظة ليست متأرجحة.RNAi يؤكد خصوصية scrunching والاستجابة للتعرض cinnamaldehyde في S.mediterranea. في غضون 180 ثانية من التعرض في المياه غير المناهية، كل التحكم RNAi ابرنش. بالمقارنة مع أي من SMTRPA واحد RNAi planarians مما يدل على أن S.mediterranea scrunching في cinnamaldehyde يتطلب SMTRPA واحد.من الضروري أن تكون متسقة وكيف يتم التلاعب الحيوانات للحد من الضوضاء وضمان إعادة إنتاج في القياسات السلوكية. ويمكن توسيع هذه المشاريع لتشمل تحليل شكل الجسم، والتي من شأنها أن تسمح لتحديد وتكميم السلوكيات الأخرى التي لا يتم التقاطها هنا.

Research

JoVE Journal

Biology

Computer-Generated Animal Model Stimuli

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

استخدام Rotorod كأسلوب للتحليل النوعي من المشي في الجرذ

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

فحوصات الوراثية الدوائية وظيفية للتلاعب تجديد مستورقة Dugesia تفرضه اليابان</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

تجميد مستورقة، التشعيع جزئي، والنسج

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...