Name: planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing
Uploaded: 2020-07-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing at JoVE.com

המחברים מודים למר טאפן גול על הערותיו על כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי NSF CAREER Grant 1555109.

1. התנהגות פלנרית כמותית
<ol><li>התקנה ניסיונית<ol><li>מניחים לוח LED מעומעם על משטח שטוח. לוח ה-LED משרת שתי מטרות: (1) לספק רקע לבן אחיד ו- (2) שישמש כמקור אור מתכוונן להשגת ניגודיות מתאימה. מניחים זירת צלחת פטרי 100 מ"מ על לוח LED. הערה: כדי להגדיל את התפוקה, ניתן להשתמש בצלחתמרובת בארות כזירה 23...

<ol>
	<li>Rink, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+systems+and+regeneration+in+planaria.">Stem cell systems and regeneration in planaria.</a> Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).</li><li>Reddien, P. W., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Planarian+Regeneration.">Fundamentals of Planarian Regeneration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+central+nervous+system:+how+easy+for+planarians.">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians.</a> Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).</li><li>Pearl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memoirs:+The+Movements+and+Reactions+of+Fresh-Water+Planarians:+A+Study+in+Animal+Behaviour.">Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour.</a> Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).</li><li>Mc Connell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).</li><li>Talbot, J., Sch&#246;tz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+planarian+wild-type+behavior+as+a+platform+for+screening+locomotion+phenotypes.">Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes.</a> Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).</li><li>Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrunching:+a+novel+escape+gait+in+planarians.">Scrunching: a novel escape gait in planarians.</a> Physical Biology. 12, 055001 (2015).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+shows+decision-making+behavior+in+response+to+multiple+stimuli+by+integrative+brain+function.">Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function.</a> Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).</li><li>Arenas, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+planarian+TRPA1+by+reactive+oxygen+species+reveals+a+conserved+mechanism+for+animal+nociception.">Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception.</a> Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).</li><li>Shomrat, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+training+paradigm+reveals+long-term+memory+in+planarians+and+its+persistence+through+head+regeneration.">An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration.</a> Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Second-Generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+Molecularly-Tractable+model+organisms.">A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms.</a> PLoS One. 5, 1-20 (2010).</li><li>Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system+development+and+regeneration+in+freshwater+planarians.">Nervous system development and regeneration in freshwater planarians.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).</li><li>Cebri&#224;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+neural-specific+genes+reveals+the+structural+and+molecular+complexity+of+the+planarian+central+nervous+system.">The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system.</a> Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).</li><li>Mineta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs.">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).</li><li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SoxB1+Activity+Regulates+Sensory+Neuron+Regeneration,+Maintenance,+and+Function+in+Planarians.">SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians.</a> Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+Dopaminergic+Neural+Network+and+Locomotion+Function+in+Planarian+Regenerates.">Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).</li><li>Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+planarian+TRPA1+homolog+mediates+extraocular+behavioral+responses+to+near-ultraviolet+light.">The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).</li><li>Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sources+of+hedgehog+modulate+neurogenesis+in+the+adult+planarian+brain.">Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smed-dynA-1+is+a+planarian+nervous+system+specific+dynamin+1+homolog+required+for+normal+locomotion.">Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion.</a> Biology Open. , 1-8 (2014).</li><li>Currie, K. W., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+lhx1/5-1+and+pitx+are+required+for+the+maintenance+and+regeneration+of+serotonergic+neurons+in+planarians.">Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians.</a> Development. 140, 3577-3588 (2013).</li><li>Hagstrom, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+cholinesterase:+molecular+and+functional+characterization+of+an+evolutionarily+ancient+enzyme+to+study+organophosphorus+pesticide+toxicity.">Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity.</a> Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).</li><li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+brain+regeneration+as+a+model+system+for+developmental+neurotoxicology.">Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology.</a> Regeneration. 3, 65-77 (2016).</li><li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+planarians+as+an+alternative+animal+model+for+neurotoxicology.">Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology.</a> Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).</li><li>Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-behavioral+endpoint+testing+of+an+87-chemical+compound+library+in+freshwater+planarians.">Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians.</a> Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).</li><li>Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+neurotoxic+potential+of+15+flame+retardants+using+freshwater+planarians.">Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians.</a> Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).</li><li>Wu, J. P., Li, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+freshwater+planarians+in+environmental+toxicology+studies:+Advantages+and+potential.">The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).</li><li>Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+assembly+and+function+in+planaria.">Analysis of ciliary assembly and function in planaria.</a> Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).</li><li>Sabry, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+or+genetic+targeting+of+Transient+Receptor+Potential+(TRP)+channels+can+disrupt+the+planarian+escape+response.">Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response.</a> PLoS One. , 753244 (2019).</li><li>Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slo1+regulates+ethanol-induced+scrunching+in+freshwater+planarians.">Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians.</a> Physical Biology. 13, 1-12 (2016).</li><li>Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+zebrafish+and+planarian+model+systems+for+developmental+neurotoxicity+screens+using+an+87-compound+library.">Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library.</a> Toxicological Sciences. , (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Behaviors+and+Wall-Curvature+Lead+to+Apparent+Wall+Preference+in+Planarian.">Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian.</a> PLoS One. 10, 0142214 (2015).</li><li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength.">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9, 114708 (2014).</li><li>Petrus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+TRPA1+in+mechanical+hyperalgesia+is+revealed+by+pharmacological+inhibition.">A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition.</a> Molecular Pain. 3, 40 (2007).</li><li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-dependent+conditional+gene+knockdown+(Readyknock)+in+planarian:+Demonstration+of+requirement+for+Djsnap-25+expression+in+the+brain+for+negative+phototactic+behavior.">Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 49, 383-394 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergic+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica.">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).</li><li>Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosensory+signaling+by+TRPM+is+processed+by+brain+serotonergic+neurons+to+produce+planarian+thermotaxis.">Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).</li></ol>

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ללמוד באופן כמותי את ההשפעות שלגירוייםפיזיים וכימיים 7,28,29 או מניפולציה גנטית (RNAi)28,29 על תנועה פלנרית. כדי למקסם את הרזולוציה המרחבית, עדיף להזיז את המצלמה קרוב ככל האפשר לזירה תוך ?...

בנוסף לפופולריות שלהם עבור תאי גזעומחקר התחדשות 1,2,3,פלנריים מים מתוקים שימשו זמן רב במחקריםהתנהגותיים 4, 5,ניצול גודלם הגדול יחסית (כמהמילימטריםבאורך), קלות ועלות נמוכה של תחזוקת מעבדה, וספקטרום רחב שלהתנהגויותנצפות. המבוא של ראייה ממוחשבת ומעקב אוטומטי ללימודיהתנהגות פלנריים 6,7,8,9,10,11 אפשרו בידול כמותי של פנוטיפים התנהגותיים. התנהגות בעלי חיים היא קריאה ישירה של תפקוד עצבי. בגלל מערכת העצבים המישנית היא בגודל בינוני ומורכבות, אבל מניות שפרו אלמנטים מרכזיים עם המוחבעל החוליות 12,13,14,לימוד התנהגות פלנרית יכול לספק תובנה לתוך מנגנונים שוחזים של פעולה עצבית אשר עשוי להיות קשה לבדיקה ישירה אורגניזמים מורכבים יותר. לפיכך, תכנון הוא מודל בעל ערך עבור מחקרי נוירוביולוגיההשוואתית 8,12,15,16,17,18,19,20,21. בנוסף, הסביבה הימית מאפשרת חשיפה מהירה ונוחה לכימיקלים כדי ללמוד את השפעתם על תפקוד המוח בהתחדשות ופלנריים בוגרים, מה שהופך אותם למערכת פופולריתלנוירו-רעלים 22,,23,,24,,25,,26.
לפלנריים יש שלוש תלינים נפרדים, המכונים גלישה, פריסלזיס, ולכיווץ. כל הליכה מוצגת בנסיבות ספציפיות: גלישה היא ההליכה המוגדרת כברירת מחדל, פריסלזיס מתרחשת כאשרפונקציית הקליארית נפרץ 7,27, ו כיווץ הוא הליכה בריחה – ללא תלות בתפקוד cilia – בתגובה לגירויים מזיקים מסוימים7. הוכנו כי כיווץ היא תגובה ספציפית, הנוזרת על ידי התחושה של רמזים כימיים או פיזיים מסוימים, כולל טמפרטורות קיצוניות או pH, פגיעה מכנית, או גורם כימי ספציפי, ולכן אינו תגובתמתח כללית 7,28,29.
בשל ספציפיותו הפרמטרים הסטריאוטיפיים שלה, אשר ניתן לכמת בקלות באמצעות פרוטוקול זה, כיווץ הוא פנוטיפ התנהגותי רב עוצמה המאפשר לחוקרים לבצע מחקרים מכניים לנתח מסלולים חושיים ושליטה עצבית שלהתנהגות 25,28. בנוסף, כיווץ כבר הראה להיות נקודת קצה רגישה כדי לומר תופעות כימיות שליליות על התפתחות מערכת העצבים ותפקוד במחקרים neurotoxicology22,24,25,30. כמו מספר מסלולים חושיים שונים נראה להתכנס כדי לגרום כיווץבאמצעות מנגנונים שונים 28, כיווץ שונה מהתנהגויות פלנריות אחרות כי שונים, אבל ספציפיים, גירויים יכולים לשמש כדי לנתח מעגלים עצביים ברורים וללמוד כיצד אותות שונים משולבים כדי לייצר את פנוטיפ מכווץ.
חשוב לציין, קיימים הבדלי מינים, כאשר כימיקל אחד עלול לעורר כיווץ במין פלנרי אחד, אך תגובה התנהגותית שונה במין אחר. לדוגמה, מצאנו כי anandamide גורם מכווץ בזן התכנון Dugesia japonica אבל גורם פריסלזיס ב Schmidtea מדיטרנה28. דוגמה זו מדגישה את החשיבות של היכולת להבחין באופן אמין בין ההליכות השונות, משום שהן ביטויים פנוטיפיים של מנגנונים מולקולריים ברורים. עם זאת, קשה להבחין בין התכתשות מהפריסטלזיס באמצעות נתונים תצפיתיים איכותיים, משום ששני הגייטים מונעים על ידי שרירים וחותקיםקווי דמיון איכותיים 7,28. לפיכך, כדי להבחין בין ההליכות יש צורך לבצע הדמיה cilia או מחקר התנהגותי כמותי, המאפשר הבחנה בהתבסס על פרמטריםאופייניים 7,28. מכיוון שהדמיית cilia היא מאתגרת מבחינה ניסיונית ודורשת ציוד מיוחד כגון מיקרוסקופ מורכב הגדלה גבוההומצלמהבמהירות גבוהה 7,28, היא אינה נגישה באופן נרחב לחוקרים כמו ניתוח התנהגותי כמותי.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור (1) אינדוקציה של כיווץ באמצעות גירויים פיזיים (רעילים, קטיעה, אור UV קרוב) וכימי (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyde) גירויים ו (2) ניתוח כמותי של התנהגות פלנרית באמצעות תוכנה זמינה בחופשיות. על ידי כימות ארבעה פרמטרים (תדירות תנודות אורך הגוף, מהירות יחסית, משרעת מקסימלית, ואמימטריה של הארכת הגוףוהתכווצות) 7, כיווץ ניתן להבדיל מגלישה, פריסלזיס, ו מצבים התנהגותיים אחרים שדווחו בספרות, כגון קטר כמו נחש15 או אפילפסיות15. יתר על כן, בעוד כיווץ הוא שוחמר בין מיניםפלנריים שונים 7, כל מין יש תדירות אופיינית משלו ומהירות; לכן, לאחר שנקבעו מהירויות הגלישה והכווץ של מין, ניתן להשתמש במהירות לבדה כאמצעי להבחין בין התכתוכות לביןגלישה ונזיד 29. הפרוטוקול אינו מניח הכשרה מוקדמת בניתוח תמונה חישובית או מחקרים התנהגותיים ולכן ניתן ליישם גם עבור ניסויים התנהגותיים תכנון בהקשר מעבדה הוראה ברמת התואר הראשון. נתונים לדוגמה כדי להקל על התאמת פרוטוקול מסופקים בחומר משלים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>377430-5G</td>
			<td>CAUTION:&#160; Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens, 2/3 25mm F/1.4&#160;</td>
			<td>Tamron</td>
			<td>23FM25SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile</td>
			<td>MedSupply Partners</td>
			<td>62-1019-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cinnamaldehyde, &#62;95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W228613-100G-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimmable A4 LED Tracer Light Box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HD631RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flea3 USB3 camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FL3-U3-13E4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-394-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td>Prepare in deionized water at 0.5 g/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montj&#252;ic salts, prepared in Milli-Q water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 20-200 &#956;L range</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17008652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 150 mL beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, 0.22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Golden Amber</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R21</td>
			<td>Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Medium Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Storaro Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco transfer pipette, 62 &#181;L large aperture</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>691TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support stand&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-947-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser pointer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B082DGS86R</td>
			<td>This is a Class II laser (405nm &#177;10nm) with output power &#60;5 mW.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing

תכנון מים מתוקים בדרך כלל לדאות בצורה חלקה דרך הנעה ciliary בצד הפתח שלהם. תנאים סביבתיים מסוימים, עם זאת, יכול לגרום צורות מונעות על ידי התנועה: פריסלזיס או כיווץ. בעוד פריסלזיס נובע פגם ciliary, כיווץ אינו תלוי בתפקוד cilia והוא תגובה ספציפית לגירויים מסוימים, כולל קטיעה, טמפרטורה מזיקה, חומציות קיצונית, ואתנול. לפיכך, שני ההליכות המונעות על ידי בשרים הם שונים מבחינה מכנית. עם זאת, הם יכולים להיות קשים להבחין איכותית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לגירויים שונים באמצעות גירויים פיזיים וכימיים שונים. אנו מפרטים את האפיון הכמותי של התכתוש, אשר ניתן להשתמש בו כדי להבחין בו פריסלזיס וגלישה, באמצעות תוכנה זמינה בחופשיות. מאז כיווץ הוא הליכה פלנרית אוניברסלית, אם כי עם הבדלים ספציפיים למינים אופייניים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב על כל מיני התכנון, בעת שימוש בשיקולים המתאימים. כדי להדגים זאת, אנו משווים את התגובה של שני המינים הפלנריים הפופולריים ביותר המשמשים במחקר התנהגותי, Dugesia japonica ו Schmidtea mediterranea, לאותה קבוצה של גירויים פיזיקליים וכימיים. יתר על כן, הייחודיות של כיווץ מאפשר פרוטוקול זה לשמש בשילוב עם הפרעות RNA ו / או חשיפה תרופתית לנתח את המטרות המולקולריות ואת המעגלים העצביים המעורבים, פוטנציאל מתן תובנה מכנית להיבטים חשובים של nociception ותקשורת עצבית-שרירית.

תפיסה חוץ עינית כמעט UV ב S. תכנון הים הים הוא TRPA1 תלוי, הוצע להיות מקושר H2O2 שחרור 17. מכיווןשחשיפהH2 O 2 גורם TRPA1 תלויים מכווץ S. מדיטרנה ו D. japonica planarians28, השלבים בסעיף 2.1.4 יכול לשמש כדי לבדוק אם חשיפה לאור UV קרוב גורם התכתשות בשני המינ...

Watch this Scientific Journal Video about Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing at JoVE.com

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

תכנון מים מתוקים מציגים שלוש חבטות (גלישה, פריסלזיס, ו כיווץ) הניתנים להבחנה על ידי ניתוח התנהגותי כמותי. אנו מתארים שיטה לגרום לכיסה באמצעות גירויים מזיקים שונים, כימות שלהם, והבחנה בין פריסלזיס וגלישה. באמצעות נוק-דאון גנטי, אנו מדגימים את הספנות של התכתשות כקריאה פנוטיפית כמותית.

התכתוב תכנון כקריאה התנהגותית כמותית עבור חישת גירויים מזיקים

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבהיר את ההתנהגות המתכננת ואת המנגנונים השניים שבבסיס התנהגות זו על ידי שילוב של ניתוח התנהגותי כמותי עם הפרעות מולקולריות וכימיות. טכניקה זו נגישה בקלות לכל רמות המיומנות כפי שהוא אינו דורש מכשירים מתקדמים או תוכנה מיוחדת כדי לקבל קריאה התנהגותית כמותית של planarians נע חינם. Scrunching יכול לשמש כדי ללמוד חריגים ב planarians, ומשמש נקודת קצה רגישה כדי להתבונן, שיבוש תפקוד מערכת העצבים הנגרמת על ידי קסנוביוטיקה ומחלות.התחל על ידי הצבת לוח LED מעומעם על משטח שטוח, אשר יספק רקע לבן אחיד והוא יכול לשמש כמקור אור מתכוונן כדי להשיג ניגודיות מתאימה. מניחים 100 מילימטר זירת צלחת פטרי על לוח LED. הר מצלמה על עמדת טבעת מעל הזירה והתאם את מיקומה, גובהה ומיקודה לפי הצורך, כך שהזירה כולה מרוכזת בתחום הצפייה וממוקדת.מלא את הזירה בכ-25 מיליליטר של מדיית החשיפה המתאימה כדי שיהיה לה עוצמת קול מרבית, הפעל את לוח ה-LED וכבה מקורות אור אחרים שעלולים להשפיע לרעה על איכות ההקלטה. זרוק פלנרית במרכז הזירה באמצעות העברה פיפטה. בעת בדיקת פתרון כימי, להעביר את planarian עם מעט מים פלנריים ככל האפשר, כך הריכוז של הכימיקל אינו משתנה באופן משמעותי.התחל להקליט נתונים כרצפי תמונות בתבנית פיג'י מקורית. עבור ניסויי גלישה, להקליט 1-2 דקות של התנהגות גלישה, עבור סקרנצ'ים או ניסויים פריסטואליים, להקליט מספיק זמן כדי ללכוד לפחות שלוש תנודות רצופות המתרחשות בקו ישר. לאחר השלמת הניסוי, סיים את ההקלטה.אם התוכנית תגיע לגבול הזירה מבלי לספק את קריטריון הסיום, תחזור התוכנית למרכז הזירה. פתחו את רצף התמונות הגולמי לניסוי בפיג'י, המירו אותו לשמונה סיביות ולהשתמש בכלי החץ או המחוון בתחתית ערימת התמונות כדי לעבור דרך רצף התמונה. כדי לחלץ פרק זמן ואזור עניין, צייר אזור מעניין המקיף את הנתיב המלא של תוכניתן באמצעות כלי המלבן.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מחסנית התמונות ובחר כפול, סמן את התיבה שבה מחסנית כפולה. הזן את המסגרות הראשונות והאחרונה של רצף העניין ולחץ על אישור. עבור ניסויי גלישה, לחלץ תקופה של גלישה שבו planarian נע לפחות פעמיים אורך הגוף שלה עבור סקרנצ'ר או ניסויים פריסטואלית.לחלץ מופע כאשר planarian עובר מינימום של שלוש תנודות גוף רצופות ומלאות בקו ישר. החל סף על מחסנית התמונה המשוכפלת כדי להפוך את התמונה למחסנית ולחלץ את הפלנרית מהרקע, להתאים את סרגלי ההזזה כך שהפלנרית כולה תסמן באדום. הערכים המדויקים תלויים באיכות ההדמיה.השאר את התיבות לרקע כהה, ערם היסטוגרמה ואל תאפס את הטווח ללא סימון. גלול לאורך מחסנית התמונות כדי להבטיח טווח סף טוב ולאחר מכן לחץ על החל. בחלון המר מחסנית לחלון בינארי, הגדר את פעולת השירות כברירת מחדל ואת הרקע לאור.בטל את סימון כל התיבות בחלון זה ולאחר מכן לחץ על אישור. תמונה בינארית המציגה לוח שחור על רקע לבן תופיע. ודאו שהתוכנית כולה גלויה בכל המסגרות של רצף התמונות.הגדר מידות על-ידי לחיצה על נתח והגדרה של מידות. סמן את התיבות עבור אזור, מרכז המסה, מיקום הערימה והתאים אליפסה ולאחר מכן לחץ על אישור. בחר את מחסנית התמונות הפתוחה ובחר לנתח ולנתח חלקיקים.בחלון ניתוח חלקיקים, בחר הצג ומסכות כדי לפתוח מחסנית חדשה המציגה את כל האובייקטים שזוהו עם הפרמטרים שנבחרו. הגדר מסנן גודל כדי להסיר רעש לא רצוי על-ידי הזנת האזור המשוער של התוכנית. לאחר מכן סמן את התיבות לקבלת תוצאות תצוגה ונקה תוצאות ולחץ על אישור.גלילה בערימה של תמונת המסיכה באמצעות המחוון בתחתית החלונית כדי לוודא שאין רעש או מסגרות ללא לוח. בחלון התוצאות, שמור את הנתונים באמצעות קובץ ושמור בשם, הוסף את סיומת ה- CSV לשם הקובץ, כדי לשמור את הנתונים כערכים מופרדים באמצעות פסיקים. לאחר נשמרים הנתונים עבור מחסנית התמונות, סגור את תוצאות מחסנית התמונות וחלונות המסיכה המתאימים.כדי לגרום לקרצוף באמצעות טמפרטורה מזיקה, מחממים מים פלנריים ב זכוכית ל-65 מעלות צלזיוס על צלחת חמה. מניחים פלנרי במרכז הזירה, ומחכים עד שהיא מתבונה זקוף ומתחיל לגלוש, ואז להתחיל להקליט. השתמש P 200 פיפטה לאט ובעקביות pipette 100 microliters של מים פלנריים שחומם מראש, פוסט הלוע על קצה הזנב של planarian כדי לגרום scrunching.תפסיק את ההקלטה, ברגע שההתכווצות תיפסק. מניחים את הפלנרית במיכל התאוששות ומחליפות את התקשורת בצלחת פטרי עם מים פלנריים טריים בטמפרטורת החדר, אם מפעילים ניסויים נוספים. כדי לגרום לקטיעה באמצעות קטיעה, העבר תוכנית למרכז הזירה והמתן עד שהתכנן יכוון את עצמו זקוף ויתחיל לגלוש.ואז להתחיל להקליט, לקטוע את planarian עם סכין גילוח נקי. לוודא שמיקום החתך עקבי לאורך ניסויים. עצור את ההקלטה ברגע שהיצירה האחורית חדלה לקרצוף.מוציאים את שני החלקים, מניחים אותם במיכל נפרד ומאפשרים להם להתחדש במשך שבעה ימים. פלנארים קטועים יכולים להיות מאוגדים מחדש לתוך מיכל הבית ברגע שהם התחדשו. פרוטוקול זה שימש כדי לבדוק אם ליד חשיפה לאור UV, גורם scrunching ב S.mediterranea ו D.japonica planarians, בעוד D.japonica planarians לקרקר, כאשר נחשפים ליד אור UV, S.mediterranea planarians או להפגין דילול זנב או ללא תגובה.כימות הפרמטרים המגרדים עבור המתכננים D.japonica שהפגינו לפחות שלושה מכווצים קו ישר רצופים, מגלה מאפיינים מגרדים פרמטרים עבור מין זה לעומת חשיפה 250 micromolar cinnamaldehyde ידוע TRPA אגוניסט אחד בעכברים, גורם scrunching ו S.mediterranea. בעוד שמתכנני D.japonica מציגים תערובת של תנועה דמוית נחש ותנודות שנקטעה על ידי גלישה או פניות ראש נמרצות. כימות של הדגימות עם לפחות שלוש תנודות רצופות, הניב ערכים נמוכים משמעותית עבור שלושה מתוך ארבעה פרמטרים אז צפוי לקרצוף D.japonica, המציין כי התנועה תנודות שנצפו אינו מקרצף.RNAi מאשר את הספציפיות של scrunching ותגובה לחשיפה cinnamaldehyde ב S.mediterranea. בתוך 180 שניות מחשיפה במים פלנריים, כל השליטה RNAi פלנרית מכווצת. בהשוואה לאף אחד SMTRPA אחד RNAi planarians המוכיחים כי S.mediterranea ממורמר cinnamaldehyde דורש SMTRPA אחד.זה חיוני כדי להיות עקבי וכיצד בעלי החיים הם מניפולציה כדי להפחית את הרעש ולהבטיח רבייה במדידות התנהגותיות. ניתן להרחיב פרויקטים אלה כך שיכללו ניתוח צורת גוף, שיאפשר זיהוי וכמות של התנהגויות פלנריות אחרות שלא נלכדו כאן.

Research

JoVE Journal

Biology

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

השימוש Rotorod כשיטה לניתוח איכותי של הליכה עכברוש

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...