Name: planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing
Uploaded: 2020-07-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing at JoVE.com

Gli autori ringraziano il signor Tapan Goel per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da NSF CAREER Grant 1555109.

1. Analisi quantitative del comportamento planaria
<ol><li>Configurazione sperimentale<ol><li>Posizionare un pannello LED dimmable su una superficie piana. Il pannello LED ha due scopi: (1) fornire uno sfondo bianco uniforme e (2) da utilizzare come sorgente luminosa regolabile per ottenere un contrasto appropriato. Posizionare un'arena di piatto Petri da 100 mm sul pannello LED. NOTA: per aumentare la velocità effettiva, una piastra multi-pozzo può essere utilizzata come arena23,</sup...

<ol>
	<li>Rink, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+systems+and+regeneration+in+planaria.">Stem cell systems and regeneration in planaria.</a> Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).</li><li>Reddien, P. W., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Planarian+Regeneration.">Fundamentals of Planarian Regeneration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+central+nervous+system:+how+easy+for+planarians.">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians.</a> Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).</li><li>Pearl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memoirs:+The+Movements+and+Reactions+of+Fresh-Water+Planarians:+A+Study+in+Animal+Behaviour.">Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour.</a> Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).</li><li>Mc Connell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).</li><li>Talbot, J., Sch&#246;tz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+planarian+wild-type+behavior+as+a+platform+for+screening+locomotion+phenotypes.">Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes.</a> Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).</li><li>Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrunching:+a+novel+escape+gait+in+planarians.">Scrunching: a novel escape gait in planarians.</a> Physical Biology. 12, 055001 (2015).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+shows+decision-making+behavior+in+response+to+multiple+stimuli+by+integrative+brain+function.">Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function.</a> Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).</li><li>Arenas, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+planarian+TRPA1+by+reactive+oxygen+species+reveals+a+conserved+mechanism+for+animal+nociception.">Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception.</a> Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).</li><li>Shomrat, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+training+paradigm+reveals+long-term+memory+in+planarians+and+its+persistence+through+head+regeneration.">An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration.</a> Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Second-Generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+Molecularly-Tractable+model+organisms.">A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms.</a> PLoS One. 5, 1-20 (2010).</li><li>Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system+development+and+regeneration+in+freshwater+planarians.">Nervous system development and regeneration in freshwater planarians.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).</li><li>Cebri&#224;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+neural-specific+genes+reveals+the+structural+and+molecular+complexity+of+the+planarian+central+nervous+system.">The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system.</a> Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).</li><li>Mineta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs.">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).</li><li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SoxB1+Activity+Regulates+Sensory+Neuron+Regeneration,+Maintenance,+and+Function+in+Planarians.">SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians.</a> Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+Dopaminergic+Neural+Network+and+Locomotion+Function+in+Planarian+Regenerates.">Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).</li><li>Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+planarian+TRPA1+homolog+mediates+extraocular+behavioral+responses+to+near-ultraviolet+light.">The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).</li><li>Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sources+of+hedgehog+modulate+neurogenesis+in+the+adult+planarian+brain.">Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smed-dynA-1+is+a+planarian+nervous+system+specific+dynamin+1+homolog+required+for+normal+locomotion.">Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion.</a> Biology Open. , 1-8 (2014).</li><li>Currie, K. W., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+lhx1/5-1+and+pitx+are+required+for+the+maintenance+and+regeneration+of+serotonergic+neurons+in+planarians.">Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians.</a> Development. 140, 3577-3588 (2013).</li><li>Hagstrom, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+cholinesterase:+molecular+and+functional+characterization+of+an+evolutionarily+ancient+enzyme+to+study+organophosphorus+pesticide+toxicity.">Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity.</a> Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).</li><li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+freshwater+planarians+in+environmental+toxicology+studies:+Advantages+and+potential.">The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).</li><li>Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+assembly+and+function+in+planaria.">Analysis of ciliary assembly and function in planaria.</a> Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).</li><li>Sabry, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+or+genetic+targeting+of+Transient+Receptor+Potential+(TRP)+channels+can+disrupt+the+planarian+escape+response.">Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response.</a> PLoS One. , 753244 (2019).</li><li>Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slo1+regulates+ethanol-induced+scrunching+in+freshwater+planarians.">Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians.</a> Physical Biology. 13, 1-12 (2016).</li><li>Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+zebrafish+and+planarian+model+systems+for+developmental+neurotoxicity+screens+using+an+87-compound+library.">Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library.</a> Toxicological Sciences. , (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Behaviors+and+Wall-Curvature+Lead+to+Apparent+Wall+Preference+in+Planarian.">Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian.</a> PLoS One. 10, 0142214 (2015).</li><li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength.">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9, 114708 (2014).</li><li>Petrus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+TRPA1+in+mechanical+hyperalgesia+is+revealed+by+pharmacological+inhibition.">A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition.</a> Molecular Pain. 3, 40 (2007).</li><li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-dependent+conditional+gene+knockdown+(Readyknock)+in+planarian:+Demonstration+of+requirement+for+Djsnap-25+expression+in+the+brain+for+negative+phototactic+behavior.">Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 49, 383-394 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergic+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica.">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).</li><li>Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosensory+signaling+by+TRPM+is+processed+by+brain+serotonergic+neurons+to+produce+planarian+thermotaxis.">Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).</li></ol>

Utilizzando questo protocollo, si possono studiare quantitativamente gli effetti degli stimoli fisici e chimici7,28,29 o manipolazione genetica (RNAi)28,29 sulla locomozione planaria. Per massimizzare la risoluzione spaziale, è meglio spostare la fotocamera il più vicino possibile all'arena, assicurandosi che l'intera arena sia nel campo di vista. Per aumentare la velo...

Oltre alla loro popolarità per le cellule staminali e la ricerca dirigenerazione 1,2,3, planarini d'acqua dolce sono stati a lungo utilizzati negli studi comportamentali4,5, sfruttando le loro dimensioni relativamente grandi (pochi millimetri di lunghezza), facilità e basso costo di manutenzione di laboratorio, e ampio spettro di comportamenti osservabili. L'introduzione della visione artificiale e il monitoraggio automatizzato agli studi sul comportamento planaria6,7,8,9,10,11 hanno permesso la differenziazione quantitativa dei fenotipi comportamentali. Il comportamento animale è una lettura diretta della funzione neuronale. Poiché il sistema nervoso planaria è di medie dimensioni e complessità, ma condivide elementi chiave conservati con il cervello vertebrato12,13,14, studiare il comportamento planaria può fornire informazioni sui meccanismi conservati di azione neuronale che possono essere difficili da sondare direttamente in organismi più complessi. Così, i planari sono un modello prezioso per gli studi comparativi di neurobiologia8,12,15,16,17,18,19,20,21. Inoltre, l'ambiente acquatico consente una rapida e facile esposizione alle sostanze chimiche per studiare il loro effetto sulla funzione cerebrale nella rigenerazione e planari adulti, rendendoli un sistema popolare per la neurotossicologia22,23,24,25,26.
I planariani possiedono tre andatte distinte, denominate planata, peristalsis e scrunching. Ogni andatura è esposta in circostanze specifiche: il volo a volo è l'andatura di default, la peristalsi si verifica quando la funzione ciliaria ècompromessa 7,27, e lo scrunching è un'andatura di fuga – indipendente dalla funzione delle ciglia – in risposta a determinati stimoli nocivi7. Abbiamo dimostrato che lo scrunching è una risposta specifica, suscitata dalla sensazione di alcuni segnali chimici o fisici, tra cui temperature estreme o pH, lesioni meccaniche o induttori chimici specifici, e quindi non è una risposta di stressgenerale 7,28,29.
A causa della sua specificità e dei parametri stereotipati, che possono essere facilmente quantificati utilizzando questo protocollo, lo scrunching è un potente fenotipo comportamentale che consente ai ricercatori di eseguire studi meccanicistici che sezionano le vie sensoriali e il controllo neuronale del comportamento25,28. Inoltre, lo scrunching ha dimostrato di essere un endpoint sensibile al saggio effetti chimici negativi sullo sviluppo del sistema nervoso e la funzione negli studi di neurotossicologia22,24,25,30. Come diversi percorsi sensoriali diversi sembrano convergere per indurre scrunching attraverso vari meccanismi28, scrunching differisce da altri comportamenti planarili perché vari, ma specifici, stimoli possono essere utilizzati per sezionare circuiti neuronali distinti e studiare come diversi segnali sono integrati per produrre il fenotipo scrunching.
È importante sottolineare che esistono differenze di specie, in cui una sostanza chimica può suscitare scrunching in una specie planaria, ma una risposta comportamentale diversa in un'altra. Per esempio, abbiamo scoperto che l'anandamide induce scrunching nella specie planaria Dugesia japonica ma induce peristalsis in Schmidtea mediterraneo28. Questo esempio evidenzia l'importanza di essere in grado di distinguere in modo affidabile tra le diverse andatte, perché sono le manifestazioni fenotipiche di meccanismi molecolari distinti. Tuttavia, la distinzione di scrunching da peristalsis è difficile utilizzando dati osservazionali qualitativi, perché entrambe le andature sono muscolatura-driven e condividono somiglianze qualitative7,28. Così, per distinguere le andatte è necessario eseguire l'imaging delle ciglia o uno studio comportamentale quantitativo, che consente la distinzione in base ai parametricaratteriali 7,28. Poiché l'imaging delle ciglia è sperimentalemente impegnativo e richiede attrezzature specializzate come un microscopio composto ad alto ingrandimento e una telecamera ad altavelocità 7,28, non è così ampiamente accessibile ai ricercatori come l'analisi comportamentale quantitativa.
Qui, presentiamo un protocollo per (1) l'induzione di scrunching utilizzando vari stimoli fisici (temperatura nocica, amputazione, luce quasi UV) e chimici (isothiocyanate allyl (AITC), cinnamaldeidede) e (2) l'analisi quantitativa del comportamento planaria utilizzando software liberamente disponibile. Quantificando quattro parametri (frequenza delle oscillazioni della lunghezza del corpo, velocità relativa, ampiezza massima e asimmetria dell'allungamento e della contrazione del corpo)7, lo scrunching può essere differenziato da planare, peristalsis e altri stati comportamentali riportati nella letteratura, come la locomozione simile a unserpente 15 o le epilessie15. Inoltre, mentre lo scrunching è conservato tra le diverse specie planariari7, ogni specie ha la sua frequenza e velocità caratteristica; pertanto, una volta determinate le velocità di planata e di tascafo di una specie, la velocità da sola può essere utilizzata come mezzo per distinguere lo scarsobo passare dal planilo e dalla peristaalsis29. Il protocollo non presuppone alcuna formazione preventiva nell'analisi computazionale delle immagini o negli studi comportamentali e quindi può essere applicato anche per esperimenti comportamentali planariari in un contesto di laboratorio didattico a livello universitario. I dati di esempio per facilitare l'adattamento del protocollo sono forniti nel materiale supplementare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>377430-5G</td>
			<td>CAUTION:&#160; Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens, 2/3 25mm F/1.4&#160;</td>
			<td>Tamron</td>
			<td>23FM25SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile</td>
			<td>MedSupply Partners</td>
			<td>62-1019-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cinnamaldehyde, &#62;95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W228613-100G-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimmable A4 LED Tracer Light Box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HD631RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flea3 USB3 camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FL3-U3-13E4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-394-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td>Prepare in deionized water at 0.5 g/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montj&#252;ic salts, prepared in Milli-Q water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 20-200 &#956;L range</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17008652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 150 mL beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, 0.22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Golden Amber</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R21</td>
			<td>Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Medium Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Storaro Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco transfer pipette, 62 &#181;L large aperture</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>691TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support stand&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-947-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser pointer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B082DGS86R</td>
			<td>This is a Class II laser (405nm &#177;10nm) with output power &#60;5 mW.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing

I planari d'acqua dolce normalmente scivolano senza problemi attraverso la propulsione ciliaria sul loro lato ventrale. Alcune condizioni ambientali, tuttavia, possono indurre forme di locomozione guidate dalla muscolatura: peristalsis o scrunching. Mentre la peristalsis deriva da un difetto ciliare, lo scrunching è indipendente dalla funzione delle ciglia ed è una risposta specifica a determinati stimoli, tra cui amputazione, temperatura nociva, pH estremo ed etanolo. Così, queste due andature moscentivamente guidate sono meccanicisticamente distinte. Tuttavia, possono essere difficili da distinguere qualitativamente. Qui, forniamo un protocollo per indurre scrunching utilizzando vari stimoli fisici e chimici. Dettagliamo la caratterizzazione quantitativa dello scrunching, che può essere utilizzata per distinguerlo dalla peristalsi e dal planata, utilizzando un software liberamente disponibile. Poiché lo scrunching è un'andatura planaria universale, anche se con differenze caratteristiche specifiche delle specie, questo protocollo può essere ampiamente applicato a tutte le specie di planari, quando si utilizzano considerazioni appropriate. Per dimostrarlo, confrontiamo la risposta delle due specie planariari più popolari utilizzate nella ricerca comportamentale, Dugesia japonica e Schmidtea mediterraneo,con lo stesso insieme di stimoli fisici e chimici. Inoltre, la specificità dello scrunching consente di utilizzare questo protocollo in combinazione con l'interferenza dell'RNA e/o l'esposizione farmacologica per sezionare gli obiettivi molecolari e i circuiti neuronali coinvolti, fornendo potenzialmente informazioni meccanicistiche su importanti aspetti della nocicezione e della comunicazione neuromuscolare.

La percezione extraoculare quasi UV in S. mediterraneo planarins è TRPA1-dipendente ed è stato proposto di essere collegato a H2O2 release17. Poichél'esposizioneH 2 O2 induce lo scrunching dipendente da TRPA1 in S. mediterraneo e D. japonica planarians28, le fasi della sezione 2.1.4 possono essere utilizzate per verificare se l'esposizione alla luce quasi UV induce scrunching in entrambe le specie. Me...

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Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

I planari di acqua dolce presentano tre andatri (gli aliante, peristalsi e scrunching) che sono distinguibili dall'analisi comportamentale quantitativa. Descriviamo un metodo per indurre scrunching utilizzando vari stimoli nocivi, quantificazione della stessa, e distinzione da peristalsis e planata. Usando l'abbattimento genico, dimostriamo la specificità dello scrunching come lettura fenotipico quantitativa.

Planarian Scrunching come una lettura comportamentale quantitativa per il rilevamento di stimoli nocivi

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di chiarire il comportamento planariano e i meccanismi sec alla base di questo comportamento combinando l'analisi comportamentale quantitativa con perturbazioni molecolari e chimiche. Questa tecnica è facilmente accessibile a tutti i livelli di abilità in quanto non richiede strumenti avanzati o software specializzati per ottenere letture comportamentali quantitative dei planari in movimento libero. Lo scrunching può essere usato per studiare l'eccezione nei planari e funge da endpoint sensibile al test, interrompendo la funzione del sistema nervoso causata da xenobiotici e malattie.Inizia posizionando un pannello LED dimmabile su una superficie piana, che fornirà uno sfondo bianco uniforme e può essere utilizzato come fonte di luce regolabile per ottenere un contrasto appropriato. Posizionare un'arena di petri da 100 millimetri sul pannello LED. Monta una telecamera su un supporto ad anello sopra l'arena e regolane la posizione, l'altezza e la messa a fuoco in base alle esigenze in modo che l'intera arena sia centrata sul campo visivo ed è a fuoco.Riempire l'arena con circa 25 millilitri del supporto di esposizione appropriato per avere il massimo volume, accendere il pannello LED e spegnere qualsiasi altra fonte di luce che possa influire negativamente sulla qualità della registrazione. Lascia cadere un planariano al centro dell'arena usando una Pipetta di trasferimento. Quando si testa una soluzione chimica, trasferire il planariano con il meno possibile di acqua planaria, in modo che la concentrazione della sostanza chimica non sia cambiata in modo significativo.Inizia a registrare i dati come sequenze di immagini in un formato Fiji nativo. Per gli esperimenti di planata, registrare da uno a due minuti di comportamento di planata, per esperimenti di scrunching o peristalisi, registrare abbastanza a lungo da catturare almeno tre oscillazioni consecutive che si verificano in linea retta. Una volta completato l'esperimento, terminare la registrazione.Se il planario raggiunge il confine dell'arena senza soddisfare il criterio di terminazione, rila tubazione il planario al centro dell'arena. Aprite la sequenza di immagini non elaborati per un esperimento nelle Figi, convertitela in otto bit e usate lo strumento freccia o il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dello stack di immagini per scorrere la sequenza di immagini. Per estrarre un periodo di tempo e un'area di interesse, disegnare un'area di interesse che comprenda il percorso completo di un planario utilizzando lo strumento rettangolo.Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo stack di immagini e selezionare duplicato, selezionare la casella in cui lo stack duplicato. Immettere il primo e l'ultimo fotogramma della sequenza di interesse e fare clic su OK. Per gli esperimenti di planata, estrarre un periodo di planatale in cui il planario si muove almeno il doppio della sua lunghezza corporea per esperimenti di scrunching o peristalisi.Estrarre un'istanza quando il planario subisce un minimo di tre oscillazioni del corpo consecutive e complete in linea retta. Applicare una soglia allo stack di immagini duplicato per binarizzare l'immagine ed estrarre il planariano dallo sfondo, regolare le barre scorrevoli in modo che l'intero planariano sia evidenziato in rosso. I valori esatti dipendono dalla qualità dell'imaging.Lascia deselezionate le caselle per lo sfondo scuro, impila l'istogramma e non reimpostare l'intervallo. Scorrere lo stack di immagini per assicurarsi un buon intervallo di soglia e quindi fare clic su Applica. Nello stack di conversione in finestra binaria impostare il metodo su default e lo sfondo su light.Deselezionare tutte le caselle di questa finestra e quindi fare clic su OK. Apparirà un'immagine binarizzata che mostra un planario nero su uno sfondo bianco. Assicurarsi che l'intero planariano sia visibile in tutti i fotogrammi della sequenza di immagini.Impostare le misurazioni facendo clic su analizza e imposta misurazioni. Selezionare le caselle relative all'area, al centro della massa, alla posizione della pila e all'ellisse di adattamento, quindi fare clic su OK. Selezionate la pila di immagini aperta e selezionate analizza e analizzate le particelle.Nella finestra analizza particelle, selezionate mostra e maschera per aprire una nuova pila che mostra tutti gli oggetti rilevati con i parametri scelti. Impostare un filtro dimensioni per rimuovere il rumore indesiderato immettendo l'area approssimativa del planariano. Quindi selezionare le caselle per visualizzare i risultati e cancellare i risultati e fare clic su OK.Scorrere lo stack di immagini della maschera utilizzando il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore del pannello per assicurarsi che non vi siano rumori o fotogrammi senza un planariano. Nella finestra dei risultati salvare i dati utilizzando il file e salvarli con nome, aggiungere l'estensione CSV al nome del file per salvare i dati come valori separati da virgole. Una volta salvati i dati per lo stack di immagini, chiudere i rispettivi risultati dello stack di immagini e mascherare le finestre.Per indurre scrunching attraverso la temperatura scioxiosa, riscaldare l'acqua planaria in un bicchiere a 65 gradi Celsius su una piastra calda. Posizionare un planariano al centro dell'arena e attendere che si orienti in posizione verticale e inizi a scivolare, quindi inizia a registrare. Utilizzare una pipetta P 200 per pipettare lentamente e costantemente 100 microlitri dell'acqua planaria preriscaldata, post faringeo sull'estremità della coda del planario per indurre lo scrunching.Interrompere la registrazione, una volta cessato lo scrunching. Posizionare il planario in un contenitore di recupero e scambiare i supporti nella piastra di Petri con acqua planaria fresca a temperatura ambiente, se si eseguono più esperimenti. Per indurre lo scricchiolio attraverso l'amputazione, trasferisci un planario al centro dell'arena e aspetta che il planariano si orienti in posizione verticale e inizi a scivolare.Quindi inizia a registrare, amputa il planario con una lama di rasoio pulita. Assicurarsi che la posizione di taglio sia coerente tra gli esperimenti. Interrompere la registrazione una volta che il pezzo anteriore ha cessato di scrunching.Rimuovere entrambi i pezzi, posizionarli in un contenitore separato e consentire loro di rigenerarsi per sette giorni. I planari amputati possono essere reincorporati nel contenitore di casa una volta rigenerati. Questo protocollo è stato utilizzato per verificare se vicino all'esposizione alla luce UV, induce scrunching in S.mediterranea e D.japonica planarians, mentre I planari di D.japonica scricchiolano, quando esposti a luce UV vicina, i planari di S.mediterranea mostrano un assottigliamento della coda o nessuna risposta.Una quantificazione dei parametri di scrunching per i planari D.japonica che hanno esibito almeno tre lanci consecutivi in linea retta, rivela caratteristiche che scrunching parametri per questa specie In contrasto l'esposizione a 250 micromolare cinnamaldeide sconosciuto TRPA un agonista nei topi, provoca scrunching e S.mediterranea. Mentre i planari D.japonica mostrano una miscela di movimento simile a un serpente e oscillatorio interrotto da scivolamento o giri vigorosi della testa. Una quantificazione dei campioni con almeno tre oscillazioni consecutive, ha prodotto valori significativamente più bassi per tre parametri su quattro poi previsti per il striminzimento in D.japonica, indicando che il moto oscillatorio osservato non è screziato.RNAi conferma la specificità dello scrunching e la risposta all'esposizione alla cinnamaldeide in S.mediterranea. Entro 180 secondi dall'esposizione in acqua planariana, tutti controllano la planaria RNAi. Rispetto a nessuno dei planari RNAi SMTRPA che dimostrino che s.mediterranea scrunching in cinnamaldeide richiede SMTRPA uno.È essenziale essere coerenti e come gli animali vengono manipolati per ridurre il rumore e garantire la riproducibilità nelle misurazioni comportamentali. Questi progetti possono essere espansi per includere l'analisi della forma del corpo, che consentirebbe l'identificazione e la quantificazione di altri comportamenti planariani che non vengono catturati qui.

Research

JoVE Journal

Biology

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