Stem Cell Educator terapi blev udviklet til behandling af type I diabetes og den anden autoimmune sygdom. Denne metode blev udviklet til at udforske molekyle mekanisme underliggende immun moderation af Stamcellepædagog terapi gennem CB-SC frigivet exosomer. Denne protokol giver vejledning om, hvordan man renser exosomer fra en menneskelig navlestrengsblod stamceller kulturer og bestemme deres immun modulering af monocytter.
Demonstration af proceduren vil være Wei Hu, en ph.d.-studerende, fra mit laboratorium. Til at begynde med centrifugeres cb-SC-det afledte konditionerede medium tre gange som beskrevet i tekstmanuskriptet og samler supernatanten i et nyt konisk rør på 50 milliliter efter hver centrifugering. Efter den tredje centrifugering filtreres den opnåede supernatant med et 0,22 mikroliterfilter, og der overføres 15 ml medie til hver 10 kilodaltoncentrifugalfilterenhed.
Centrifuger ved 4, 000 x g i 30 minutter for at isolere de koncentrerede exosome medier. Overfør de koncentrerede exosomer til et ultracentrifugerør. Derefter pellet exosomer på 100, 000 x g i 80 minutter ved fire grader Celsius.
Derefter kasseres supernatant og resuspend de pelleterede exosomer i 10 milliliter PBS. Udfør en endelig ultracentrifugering for at indsamle exome pellet og resuspend det i 200 mikroliter af PBS. Tilsæt 30 millioner menneskelige PBM'er til et 15 milliliterrør og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Opslænt cellerne i 300 mikroliter af kold PBS og tilsæt 60 mikroliter cd14 mikroperler. Bland godt og inkuber cellerne på is i 15 minutter. Der tilsættes yderligere seks milliliter kold PBS og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Derefter resuspend de pelleterede celler i 500 mikroliter af kold kører buffer. Sæt skillesøjlen i magnetseparatoren og vask den tre gange med to milliliter koldløbsbuffer. Overfør de resuspenderede celler til separationskolonnen, og lad dem passere.
Igen, vaske kolonnen tre gange med to milliliter løbebuffer per vask. Løft derefter kolonnen fra magnetseparatoren og læg den over et 15 milliliter centrifugerør på is. Eluter cd14 positive celler med to milliliter koldløb buffer og centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius at pellet cellerne.
Pelletsuspendrer pellet i to milliliter koldt kemisk defineret serummedium og overfører 50 mikroliter af den til et 1,5 milliliterrør. Pletten de opnåede celler med 10 mikroliter krome Orange-konjugeret anti-human CD14 monoklonale antistoffer i 20 minutter. Der tilsættes en milliliter PBS og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter for at pelletere cellerne.
Opslæmning af cellepillerne i 200 mikroliter AF PBS og overføre det til en fem milliliter rør. Bestemme renheden af CD14+monocytter ved flowcytometri. Frø en million af de opnåede renset monocytter i et væv kultur behandlet seks-brønd plade og inkubere i to timer ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid.
Efter inkubation kassere supernatant og forsigtigt tilføje to milliliter af 37 graders forvarmt kemisk defineret serum-fri kultur medium, derefter tilføje 80 mikrogram af CB-SC-afledte exosomer til monocyt kultur i seks-brønd plade med et samlet volumen på to milliliter. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid i tre til fire dage. Derefter billede cellen morfologi ved hjælp af en omvendt mikroskop ved 200X forstørrelse.
Tilføj en milliliter PBS-baseret celle dissociation buffer til at frigøre cellerne ved pipettering op og ned og høste de resterende celler med en celle skraber. Cellerne opsamls ved centrifugering ved 1, 690 x g i fem minutter, og de skal opslæskes i 200 mikroliter PBS. Tilføj fem mikroliter af FC-blokker for at blokere den ikke-specifikke binding, og tilsæt derefter antistofferne.
Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 30 minutter. Tilsæt en milliliter PBS til de inkuberede celler og centrifuge dem ved 300 x g i 10 minutter. Pelletsuspendrer pelletet i 200 mikroliter PBS og tilsættes fem mikroliter propidiumidodid pr. prøve.
Overfør cellerne til et nyt fem milliliterflowrør, og udfør flowcytometri for at evaluere niveauerne af CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 og CD209-udtryk. CB-SC'ernes fænotype og renhed blev undersøgt ved flowcytometri med CB-SC-tilknyttede markører. Analysen viste høje niveauer af CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og galectin 9 udtryk, men ingen udtryk for CD34 blev observeret.
Flow cytometri analyse bekræfter også udtrykket af exome specifikke markører, CD9, CD 81, og CD63 på CB-SC-afledte exosomer. Størrelsen morfologi af exosomer var karakteriseret ved TEM og størrelsesfordelingen blev bestemt af DLS. Western blot yderligere bevise udtryk for exome tilhørende markør Alix uden udtryk for ER tilhørende markør, calnexin.
Den direkte interaktion mellem Dio-mærket CB-SC-Exo med PBMC blev observeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. For bedre at kunne definere, hvilken cellepopulation der interagerede med den kaldte cb-SC-Exo, blev forskellige cellerum gated med cellespecifikke markører, såsom CD3 til T-celler, CD11C for myeloid dendritiske celler, CD14 for monocytter, CD19 for B-celler og CD56 for NK-celler. Monocytter blev primært ramt af CB-SC-afledte eksosomer, da de udviste højere median fluorescensintensitet end andre immuncellers.
De exosom behandlede monocytter med succes differentieret i spindel-lignende morfologier. Der var en opregulering i niveauet af M2 associerede markører, såsom CD163, CD206, og CD209 efter behandlingen med CB-SC-afledte exosomer. Fænotopypisk sammenligning mellem konventionelle M2-makrofager og CB-SC exome-induceret M2-makrofager viste ingen væsentlige forskelle.
Det vigtigste skridt i denne protokol er at tilføje CB-SC-afledte exosomer til monocyt af kultur i seks-brønd plade og inkubere det i tre til fire dage, som er nødvendige for cellens differentiering til andre type 2 makrofager med spindel-lignende morfologi. Dernæst vil vi udforske molekylekomponenterne inde i CB-SC-afledte exosomer, der bidrog til induktionen af differentiering af monocyt i type 2 makrofager.