Name: flow cytometric characterization of murine b cell development
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development at JoVE.com

We danken Matthew Sleeman voor het kritisch lezen van het manuscript. We bedanken ook de afdelingen Vivarium Operations en Flow Cytometry Core van Regeneron voor het ondersteunen van dit onderzoek.

Alle muisstudies werden gecontroleerd en goedgekeurd door Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het experiment werd uitgevoerd op weefsels van drie C57BL / 6J vrouwelijke muizen (17 weken oud) van Jackson Laboratories. Titreer alle antilichamen voordat u met het experiment begint om de ideale concentratie te bepalen. Wanneer u compensatiekralen gebruikt voor compensatie in één kleur, zorg er dan voor dat ze net zo helder of helderder kleuren dan uw monsters. Bewaar alle buffers, antilichamen ...

<ol>
	<li>Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+therapy+with+monoclonal+antibodies+and+related+proteins.">Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins.</a> Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).</li><li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+in+situ+genetic+humanization+of+6+Mb+of+mouse+immunoglobulin+genes.">Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).</li><li>Murphy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+with+megabase+humanization+of+their+immunoglobulin+genes+generate+antibodies+as+efficiently+as+normal+mice.">Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).</li><li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa-on-Heavy+(KoH)+bodies+are+a+distinct+class+of+fully-human+antibody-like+therapeutic+agents+with+antigen-binding+properties.">Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).</li><li>Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+biology+and+development.">B-cell biology and development.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).</li><li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development.">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).</li><li>Lund, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-producing+B+lymphocytes-key+regulators+of+immunity.">Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).</li><li>Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-B-cell+receptor.">The pre-B-cell receptor.</a> Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).</li><li>von Boehmer, H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Goodnow, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunoglobulin+expression+and+functional+silencing+of+self-reactive+B+lymphocytes+in+transgenic+mice.">Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice.</a> Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).</li><li>Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+antigen+tunes+the+responsiveness+of+naive+B+cells+but+not+T+cells.">Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells.</a> Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).</li><li>Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+that+control+B+cell+development.">Checkpoints that control B cell development.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).</li><li>Henderson, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Rac-dependent+checkpoint+in+B+cell+development+controls+entry+into+the+splenic+white+pulp+and+cell+survival.">A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).</li><li>Pillai, S., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+follicular+versus+marginal+zone+B+lymphocyte+cell+fate+decision.">The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).</li><li>Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Development+in+the+Bone+Marrow+Is+Regulated+by+Homeostatic+Feedback+Exerted+by+Mature+B+Cells.">Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells.</a> Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).</li><li>Nemazee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+central+tolerance+for+B+cells.">Mechanisms of central tolerance for B cells.</a> Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).</li><li>Petkau, G., Turner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+circuits+that+direct+early+B-cell+development.">Signalling circuits that direct early B-cell development.</a> Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry:+An+Overview.">Flow Cytometry: An Overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).</li><li>Betters, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Flow+Cytometry+in+Clinical+Practice.">Use of Flow Cytometry in Clinical Practice.</a> Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Van Epps, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+order+to+early+B+cell+chaos.">Bringing order to early B cell chaos.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).</li><li>Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+characterization+of+pro-B+and+pre-pro-B+cell+stages+in+normal+mouse+bone+marrow.">Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).</li><li>Allman, D., Pillai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+B+cell+subsets.">Peripheral B cell subsets.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).</li><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plasma-cell+development.">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li><li>Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+B+cell-deficient+mouse+by+targeted+disruption+of+the+membrane+exon+of+the+immunoglobulin+mu+chain+gene.">A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene.</a> Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).</li><li>Keenan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Censoring+of+autoreactive+B+cell+development+by+the+pre-B+cell+receptor.">Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor.</a> Science. 321 (5889), 696-699 (2008).</li><li>Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+B+lymphocyte+populations+in+Lyn-deficient+mice+and+the+role+of+Lyn+in+signal+initiation+and+down-regulation.">Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation.</a> Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).</li><li>Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+CD45+expression+unmask+functions+for+CD45+in+B-cell+development,+tolerance,+and+survival.">Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).</li><li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proliferation+of+B+cells+and+auto-immunity+in+mice+lacking+protein+kinase+Cdelta.">Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta.</a> Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).</li><li>Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+B-cell+survival+by+BAFF-dependent+PKCdelta-mediated+nuclear+signalling.">Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling.</a> Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-engaged+B+cells+undergo+chemotaxis+toward+the+T+zone+and+form+motile+conjugates+with+helper+T+cells.">Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells.</a> PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).</li><li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry.">Flow Cytometry.</a> Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).</li><li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+analysis+in+flow+cytometry:+the+future+just+started.">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies.">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies.</a> European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).</li><li>Bigos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+index:+an+easy-to-use+metric+for+evaluation+of+different+configurations+on+the+same+flow+cytometer.">Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer.</a> Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).</li><li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+and+autoimmunity.">B cells and autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).</li></ol>

Flowcytometrische analyse van lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels heeft sinds de jaren 1980 gelijktijdige identificatie en opsomming van B-celsubpopulaties bij muizen en mensen mogelijk gemaakt. Het is gebruikt als een maat voor humorale immuniteit en kan verder worden toegepast om de functionaliteit van de B-cel te evalueren. Deze methode maakt gebruik van de beschikbaarheid van reagens om verschillende stadia van B-celrijping bij muizen en mensen te beoordelen, door middel van gelijktijdige analyse van meerdere parame...

Monoklonale antilichamen zijn in toenemende mate de keuzetherapie geworden voor veel menselijke ziekten, omdat ze deel gaan uitmaken van de reguliere geneeskunde1,2. We hebben eerder genetisch gemanipuleerde muizen beschreven die efficiënt antilichamen produceren die volledig menselijke variabele gebieden herbergen met muis IgH-constanten3,4. Onlangs hebben we genetisch gemanipuleerde muizen beschreven die antilichaamachtige moleculen produceren die verschillende antigeenbinding5 hebben. Antilichamen worden uitgescheiden door B-cellen en vormen de basis van adaptieve humorale immuniteit. Er zijn twee verschillende soorten B-cellen, B-1 en B-2. Bij zoogdieren ontstaan B-1-cellen in de foetale lever en worden ze na de geboorte verrijkt in slijmvliesweefsels en de pleurale en peritoneale holtes, terwijl B-2-cellen vóór de geboorte ontstaan in de foetale lever en daarna in het beenmerg (BM). B-2 cellen worden verrijkt in secundaire lymfoïde organen, waaronder de milt en het bloed6,7,8. In de BM beginnen B-2 hematopoietische voorlopers te differentiëren naar pro-B-cellen bij de initiatie van Ig mu zware ketenherschikking9,10. Succesvolle herschikking van de zware keten van Ig en de assemblage ervan in de pre-B-celreceptor (pre-BCR), samen met signalering en proliferatieve expansie, leidt tot differentiatie naar pre-B-cellen. Nadat pre-B-cellen hun Ig kappa (Igκ), of indien onproductief, Ig lambda (Igλ) lichte ketens herschikken, paren ze met μ zware keten, wat resulteert in oppervlakte IgM BCR-expressie. Het is belangrijk erop te wijzen dat bekend is dat de expressie van het IgM-oppervlak verminderd is onder omstandigheden van autoreactiviteit, waardoor wordt bijgedragen aan zelftolerantie in functioneel niet-reagerende of anerge B-cellen11,12. Onrijpe B-cellen komen dan in een overgangsfase, waar ze IgD beginnen te co-expresseren en migreren van de BM naar de milt. In de milt neemt de IgD-expressie verder toe en rijpen de cellen tot een tweede fase van overgangs-B-cellen, gevolgd door voltooiing van hun rijpingsstatus en ontwikkeling tot marginale zone (MZ) of folliculaire (Fol) cellen13,14,15. Bij volwassen muizen, in een niet-zieke omgeving, blijft het aantal volwassen B-cellen constant, ondanks dat er dagelijks 10-20 miljoen onrijpe B-cellen in de BM worden gegenereerd. Hiervan komt slechts drie procent in de poel van volwassen B-cellen. De grootte van het perifere B-celcompartiment wordt beperkt door celdood, deels als gevolg van verschillende factoren, waaronder zelfreactiviteit en onvolledige rijping16,17,18. Flowcytometrische analyse is uitgebreid gebruikt om veel subcompartimenten van immuuncellen bij mensen en muizen te karakteriseren en op te sommen. Hoewel er enkele overeenkomsten zijn tussen menselijke en muriene B-celcompartimenten, is dit protocol alleen van toepassing op de analyse van muriene B-cellen. Dit protocol is ontwikkeld met het doel om genetisch gemanipuleerde muizen te fenotyperen, om te bepalen of genetische manipulatie de ontwikkeling van B-cellen zou veranderen. Flowcytometrie is ook enorm populair geweest in veel andere toepassingen, waaronder bij het meten van celactivering, functie, proliferatie, cyclusanalyse, DNA-inhoudsanalyse, apoptose en celsortering 19,20.
Flowcytometrie is het instrument bij uitstek om verschillende lymfocytencompartimenten bij muizen en mensen te karakteriseren, inclusief in complexe organen zoals de milt, BM en bloed. Vanwege de algemeen beschikbare muisspecifieke antilichaamreagentia voor flowcytometrie kan deze techniek worden gebruikt om niet alleen celoppervlakeiwitten te onderzoeken, maar ook intracellulaire fosfoproteïnen en cytokines, evenals functionele uitlezingen21. Hierin laten we zien hoe flowcytometrie-reagentia kunnen worden gebruikt om B-cellensubsets te identificeren terwijl ze rijpen en differentiëren in secundaire lymfoïde organen. Na optimalisatie van kleuringsomstandigheden, monsterverwerking, correcte instrumentopstelling en gegevensverzameling, en ten slotte gegevensanalyse, kan een protocol voor uitgebreide flowcytometrische analyse van het B-celcompartiment bij muizen worden gebruikt. Een dergelijke uitgebreide analyse is gebaseerd op een decennia oude nomenclatuur bedacht door Hardy en collega's, waarbij de ontwikkeling van BM B-2-cellen kan worden verdeeld in verschillende fracties (fraction), afhankelijk van hun expressie van B220, CD43, BP-1, CD24, IgM en IgD22. Hardy et al., toonden aan dat B220+ CD43 BM B-cellen kunnen worden onderverdeeld in vier subsets (Fractie A-C') op basis van BP-1 en CD24 (30F1) expressie, terwijl B220+ CD43-(dim to neg) BM B-cellen kunnen worden opgelost in drie deelverzamelingen (Fractie D-F) op basis van differentiële expressie van IgD en oppervlakte IgM23. Fractie A (pre-pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1- CD24 (30F1)-, Fractie B (vroege pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1- CD24 (30F1)+, Fractie C (late pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1+ CD24 (30F1)+, en Fractie C' (vroege pre-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1+ en CD24high. Verder worden Fractie D (pre-B-cellen) gedefinieerd als B220+ CD43- IgM- B-cellen, en Fractie E (nieuw gegenereerde B-cellen, combinatie van onrijp en overgangscellen) worden gedefinieerd als B220+ CD43- IgM+ B-cellen en Fractie F (volwassen, recirculterende B-cellen) worden gedefinieerd als B220high CD43- IgM+ B-cellen. Daarentegen kan de meerderheid van de naïeve B-cellen in de milt worden onderverdeeld in volwassen (B220+ CD93-) B-cellen en overgangscellen (T1, T2, T3), afhankelijk van de expressie van CD93, CD23 en IgM. Volwassen B-cellen kunnen worden opgelost in marginale zone- en folliculaire subsets op basis van expressie van IgM en CD21/CD35, en folliculaire subsets kunnen verder worden onderverdeeld in volwassen folliculaire type I en folliculaire type II B celsubsets, afhankelijk van het niveau van hun IgM- en IgD-oppervlakte-expressie24. Deze milt B-celpopulaties drukken voornamelijk Igκ lichte keten uit. Ten slotte zijn B-1 B-celpopulaties, die hun oorsprong vinden in de foetale lever en voornamelijk worden aangetroffen in de peritoneale en pleurale holtes van volwassen muizen, beschreven in de literatuur. Deze peritoneale B-cellen kunnen worden onderscheiden van de eerder beschreven B-2 B-cellen door hun gebrek aan CD23-expressie. Ze worden vervolgens verder onderverdeeld in B-1a- of B-1b-populaties, waarbij de eerste wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van CD5 en de laatste door de afwezigheid ervan25. B-1 cel voorlopercellen zijn overvloedig aanwezig in de foetale lever, maar worden niet gevonden in volwassen BM. Hoewel B-1a- en B-1b-cellen afkomstig zijn van verschillende voorlopers, zaaien ze beide de peritoneale en pleurale holtes24. In tegenstelling tot B-2-cellen zijn B-1-cellen uniek in staat tot zelfvernieuwing en zijn ze verantwoordelijk voor de productie van natuurlijke IgM-antilichamen.
Defecten in de ontwikkeling van B-cellen kunnen zich in veel gevallen voordoen, waaronder tekortkomingen in de componenten van de BCR26,27, verstoringen van signaalmoleculen die de BCR-signaalsterkte beïnvloeden14,28,29, of verstoring van cytokines die de overleving van B-cellen moduleren30,31 . Flowcytometrie-analyse van de lymfoïde compartimenten heeft bijgedragen aan de karakterisering van de B-celontwikkelingsblokken bij deze muizen en vele anderen. Een voordeel van flowcytometrische analyse van lymfoïde compartimenten is dat het de mogelijkheid biedt om metingen te doen op individuele cellen verkregen uit levend gedissocieerd weefsel. De beschikbaarheid van reagentia in een steeds groter wordend bereik van fluoroforen maakt de gelijktijdige analyse van meerdere parameters mogelijk en maakt de beoordeling van B-cel heterogeniteit mogelijk. Bovendien vormt de opsomming van B-cellen door flowcytometrische analyse een aanvulling op andere immunologische testen, zoals immunohistochemische methoden die cellokalisatie in lymfoïde organen visualiseren, detectie van circulerende antilichaamniveaus als een maat voor humorale immuniteit, evenals twee fotonmicroscopie om B-celresponsen in reële ruimte en tijd te meten32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22363611</td>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mM MACS SmartStrainer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-110-916&#160;</td>
			<td>70 mM cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U bottom plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td>GIBCO&#160;</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acroprep Advance 96 Well Filter Plate</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>8027</td>
			<td>filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-0452-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552844</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A8577</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-1</td>
			<td>BD</td>
			<td>740882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>566349</td>
			<td>brilliant stain buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD</td>
			<td>563168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21/35</td>
			<td>BD</td>
			<td>562756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>740216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 (HSA)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>138504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>561388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BD</td>
			<td>553270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5</td>
			<td>BD</td>
			<td>563194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BD</td>
			<td>740750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extended Fine Tip Transfer Pipette</td>
			<td>Samco</td>
			<td>233</td>
			<td>disposable transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSymphony A3 flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>custom order</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>Fc block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>automated dissociation tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td>tissue dissociator instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GR1 (Ly6C/6G)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-5790-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kappa</td>
			<td>BD</td>
			<td>550003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>407308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde, 32% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>426103</td>
			<td>monocyte blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575038</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>cell counter instrument&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric characterization of murine b cell development

Uitgebreide studies hebben de ontwikkeling en differentiatie van muriene B-cellen in secundaire lymfoïde organen gekenmerkt. Antilichamen die door B-cellen worden uitgescheiden, zijn geïsoleerd en ontwikkeld tot gevestigde therapieën. Validatie van de ontwikkeling van muizen B-cellen, in de context van auto-immuungevoelige muizen, of bij muizen met een gemodificeerd immuunsysteem, is een cruciaal onderdeel van het ontwikkelen of testen van therapeutische middelen bij muizen en is een geschikt gebruik van flowcytometrie. Gevestigde cytometrische parameters van de B-celstroom kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling van B-cellen in het peritoneum van het muizenvlies, het beenmerg en de milt te evalueren, maar er moeten een aantal best practices worden nageleefd. Bovendien moet flowcytometrische analyse van B-celcompartimenten ook aanvullende uitlezingen van B-celontwikkeling aanvullen. Gegevens die met behulp van deze techniek worden gegenereerd, kunnen ons begrip van wilde, auto-immuungevoelige muismodellen en gehumaniseerde muizen bevorderen die kunnen worden gebruikt om antilichamen of antilichaamachtige moleculen als therapeutica te genereren.

Hier presenteren we de gating-strategie voor het karakteriseren van B-celontwikkeling in muisperitoneum, BM en milt. De basis van de analyse wordt gevormd rond het concept van kleuring met levensvatbaarheidskleurstof, vervolgens het uitzetten van doubletten op basis van de Forward-Scatter-Area (FSC-A) en Forward-Scatter-Height (FSC-H), en ten slotte het uitzetten van puin door cellen te selecteren op basis van hun FSC-A en Side-Scatter-Area (SSC-A) kenmerken, hier aangeduid als de size ga...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development at JoVE.com

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Gegevens die met behulp van deze techniek worden gegenereerd, bevorderen een goed begrip van auto-immuungevoelige muismodellen, evenals gehumaniseerde muizen, die kunnen worden gebruikt voor algemene antilichaam- of antilichaamlevenstherapieën. De beschikbaarheid van reagentia met een steeds groter wordend bereik van fluoroforen, maakt de gelijktijdige analyse van meerdere parameters op individuele cellen mogelijk en maakt de beoordeling van B-cel heterogeniteit mogelijk. Dit protocol is ontwikkeld met als doel het fenotyperen van genetisch gemanipuleerde muizen.om te bepalen of genetische manipulatie de ontwikkeling van B-cellen zou veranderen. Hallo, ik ben Faith Harris. Ik zal de procedure vandaag demonstreren.Begin met het aliquoteren van een miljoen van elk celtype van elk dier in een 96-well U-bottom plaat. Zorg ervoor dat er voldoende putten beschikbaar zijn voor alle monsters en controles, inclusief volledige vlek-, fluorescentie-minus-één monsters en niet-gekleurde monsters voor elke fluorofoor. Voor het beenmergrijpingspaneel en het miltrijpingspaneel, aliquot cellen in twee putten, 1 miljoen cellen per put voor elk volledig vlekmonster.Voor de single color compensation levensvatbaarheidscontroles, voeg twee miljoen cellen elk van elk celtype toe aan individuele putten. Centrifugeer de plaat bij 845 x g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant door de plaat snel om te keren en over een gootsteen te vegen, waarbij u ervoor zorgt dat de putten niet kruisbevuilen.Was de cellen tweemaal in 200 microliter DPBS. Centrifugeer en decanteer het supernatant na elke wasbeurt. Resuspend de cellen in 100 microliter levensvatbaarheidskleurstof verdund in DPBS in de verhouding van één tot 1000, waarbij de cellen die worden gebruikt voor een enkele kleurcompensatie worden vermeden.Laat voor elke vlekkenset verschillende onbevlekte putten achter voor een volledig onbevlekt monster en andere controles die u mogelijk nodig hebt, evenals een extra niet-gekleurde put voor levensvatbaarheid FMO-controle. Voeg PBS toe aan deze putten. Resuspend de cellen van single color compensation levensvatbaarheidscontroles in 200 microliter verdunde levensvatbaarheidskleurstof.Breng 100 microliter van deze cellen over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en verwarm deze gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius en breng de verwarmde cellen vervolgens terug naar de oorspronkelijke put met de resterende levende cellen. Incubeer de cellen bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten beschermd tegen licht. Centrifugeer na de incubatie de cellen en decanteer het supernatant door de plaat te vegen of om te keren zonder de andere putten te kruisvervuilen.Was de cellen door resuspendatie in 200 microliter DPBS, centrifugeer en decanteer het supernatant zoals voorheen. Herhaal de DPBS-wasbeurt opnieuw. Voeg microliter FC-blok verdund met vlekbuffer toe in een verhouding van één tot 50 om een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter te krijgen.Voeg voor peritoneale cellen vijf microliter monocytenblokker toe om de niet-specifieke kleuring te verminderen. Incubeer vervolgens de cellen bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten, beschermd tegen licht. Bereid volledige vlekmastermengsels en FMO's in de vlekbuffer voor een eindvolume van 100 microliter per miljoen cellen met behulp van de antilichaamtabellen in het tekstmanuscript.Zonder fc-blok te verwijderen, voegt u 100 microliter volledige vlekmengsels en FMO's toe aan geselecteerde putten. Bereid enkelvoudige kleurcompensatiecontroles voor elk antilichaam en een vlekkenset voor. Volg de aanwijzingen van de fabrikant als u compensatiekralen gebruikt.Incubeer de cellen en de kralen bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht. Centrifugeer en decanteer vervolgens het supernatant door de plaat om te keren en te vegen. Was de cellen en kralen drie keer in 200 microliter vlekbuffer en centrifugeer en decanteer het supernatant elke keer.Resuspend de cellen en kralen in 200 microliter 2% paraformaldehyde in DPBS om de monsters te fixeren voor analyse. Incubeer de cel en kralen bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht, centrifugeer en decanteer vervolgens het supernatant door de plaat om te keren of te vegen. Resuspend de cellen en kralen in 200 microliter vlekbuffer.Plaats een filterplaat over een schone 96-well U-bottom plaat en breng elk monster over naar een put van de filterplaat met behulp van een multipipet. Centrifugeer de filterplaat en decanteer het supernatant. Voor de beenmerg- en miltrijpingspanelen, resuspend de volledig gekleurde cellen in 100 microliter vlekbuffer.Combineer de twee putten voor elk dier in één put. Resuspend de resterende panelen, FMO's en controles in 200 microliter vlekbuffer. Incubeer vaste cellen en kralen bij vier graden Celsius 's nachts, beschermd tegen licht.Registreer compensatiecontroles voor elk vlekpaneel met behulp van de voorbereide enkele vlekcompensaties en stel positieve en negatieve poorten in voor elk monster. Bereken de compensatiematrix met behulp van de software. Begin met het verkrijgen van het eerste monster en zorg ervoor dat de poorten op de juiste manier zijn ingesteld.Stel de machine in om de verschillende celgebeurtenissen voor elk monster uit te voeren en vast te leggen, zoals vermeld in het tekstmanuscript. Ga verder met gegevensanalyse met behulp van flowcytometrie-analysesoftware, volgens de gatingstrategieën in het tekstmanuscript. Flowcytometrische analyse voor karakterisering van peritoneale B-cellen in het peritoneum toont de frequenties van levensvatbare peritoneale cellen, totale B-cellen, B-1- en B-2-subsets, evenals B-1a- en B-1b-cellen bij muizen.Wanneer beenmerg B-cellen werden geanalyseerd, werden frequenties van levensvatbare cellen, totale B-cellen, Fractie A, pre-pro-B-cellen, Fractie B, Fractie C, Fractie C'Fractie D, onrijpe Fractie E, overgangsfractie E en fractie F B-cellen in muizen bepaald. Analyse van milt B-cellen toont de frequenties van levensvatbare miltcellen, totale B-cellen, overgangs B-cellen, T1, T2, T3-cellen, volwassen B-cellen, folliculaire I-cellen, folliculaire II-cellen, precursor- en volwassen marginale zonecellen en B-1-cellen bij muizen. De frequenties van immunoglobuline kappa en immunoglobuline lambda B cellen bij muizen werden bepaald met flow cytometrische analyse van de milt.Wanneer u dit protocol uitvoert, moet u het signaal van de ene detector die overloopt in de volgende oplossen met behulp van compensatieregelaars. Deze controles kunnen cel afzonderlijk gekleurd zijn of met commercieel verkrijgbare compensatiekralen. Aanvullende testen kunnen worden gebruikt in combinatie met flowcytometrie, zoals immunohistochemie om cellokalisatie in lymfoïde organen te visualiseren, evenals twee fotonenmicroscopie om B-celresponsen in realtime en tijd te analyseren.Flowcytometrie-analyse van de B-celcompartimenten maakt karakterisering mogelijk van fenotypen geassocieerd met BCR en gerelateerde tekortkomingen, verstoringen van BCR-signaalmoleculen of verstoring van cytokines die de overleving van B-cellen moduleren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Een muizenmodel van groep B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginale Kolonisatie

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...