Name: flow cytometric characterization of murine b cell development
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development at JoVE.com

Agradecemos matthew Sleeman pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também aos departamentos do Vivarium Operations and Flow Cytometry Core da Regeneron por apoiarem esta pesquisa.

Todos os estudos sobre camundongos foram supervisionados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Regeneron. O experimento foi realizado em tecidos de três camundongos C57BL/6J femininos (17 semanas de idade) dos Laboratórios Jackson. Titular todos os anticorpos antes de iniciar o experimento para determinar a concentração ideal. Ao usar contas de compensação para compensação de cor única, certifique-se de que elas colorem tão brilhantes ou brilhantes do que suas amostras. ...

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	<li>Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+therapy+with+monoclonal+antibodies+and+related+proteins.">Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins.</a> Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).</li><li>Macdonald, L. 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A análise citométrica do fluxo de tecidos linfoides e não linfoides permitiu a identificação e enumeração simultânea de sub-populações de células B em camundongos e humanos desde a década de 1980. Tem sido usado como uma medida de imunidade humoral e pode ser aplicado ainda mais para avaliar a funcionalidade de células B. Este método aproveita a disponibilidade de reagentes para avaliar diferentes estágios de maturação celular B em camundongos e humanos, por meio da análise simultânea de múltiplos par...

Os anticorpos monoclonais têm se tornado cada vez mais a terapia de escolha para muitas doenças humanas à medida que se tornam parte da medicina convencional1,2. Descrevemos anteriormente camundongos geneticamente modificados que produzem anticorpos de forma eficiente abrigando regiões variáveis totalmente humanas com constantes de IgH de camundongos3,4. Mais recentemente, descrevemos camundongos geneticamente modificados que produzem moléculas semelhantes a anticorpos que têm antígeno-vinculativos distintos5. Anticorpos são secretados por células B e formam a base da imunidade humorativa adaptativa. Existem dois tipos distintos de células B, B-1 e B-2. Em mamíferos, as células B-1 originam-se no fígado fetal e são enriquecidas em tecidos mucosas e nas cavidades pleural e peritoneal após o nascimento, enquanto as células B-2 se originam no fígado fetal antes do nascimento e posteriormente na medula óssea (MMO). As células B-2 são enriquecidas em órgãos linfoides secundários, incluindo o baço e o sangue 6,7,8. No BM, progenitores hematopoiéticos B-2 começam a se diferenciar para células pró-B após o início do rearranjo da cadeia pesada Ig mu9,10. O rearranjo bem sucedido da cadeia pesada de Ig e sua montagem no receptor de células pré-B (pré-BCR), juntamente com sinalização e expansão proliferativa, leva à diferenciação das células pré-B. Depois que as células pré-B reorganizam suas cadeias leves Ig kappa (Igκ), ou se improdutivas, Ig lambda (Igλ), elas combinam com μ corrente pesada, resultando na expressão IgM BCR superficial. É importante ressaltar que a expressão superficial IgM é conhecida por ser reduzida em condições de autoreatividade, contribuindo assim para a auto tolerância em células B funcionalmente não respondidas ou argicasas11,12. As células B imaturas então entram em um estágio de transição, onde começam a co-expressar IgD e migram do BM para o baço. No baço, a expressão igD aumenta ainda mais e as células amadurecem em um segundo estágio de células B transitórias, seguidas pela conclusão de seu status de maturação e desenvolvimento em células de zona marginal (MZ) ou folicular (Fol)13,14,15. Em camundongos adultos, em um ambiente não doente, o número de células B maduras permanece constante, apesar de 10-20 milhões de células B imaturas serem geradas diariamente no BM. Destes, apenas 3% entram no pool de células B maduras. O tamanho do compartimento celular B periférico é limitado pela morte celular, devido em parte a vários fatores, incluindo auto-reatividade e maturação incompleta16,17,18. A análise citométrica de fluxo tem sido amplamente usada para caracterizar e enumerar muitos subcompartimentais de células imunes em humanos e camundongos. Embora existam algumas semelhanças entre compartimentos de células B humanas e murinas, este protocolo se aplica apenas à análise de células murinas B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados, para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. A citometria de fluxo também tem sido extremamente popular em muitas aplicações adicionais, incluindo na medição da ativação celular, função, proliferação, análise de ciclo, análise de conteúdo de DNA, apoptose e classificação celular 19,20.
A citometria de fluxo é a ferramenta escolhida para caracterizar vários compartimentos de linfócitos em camundongos e humanos, inclusive em órgãos complexos como o baço, BM e sangue. Devido a reagentes de anticorpos específicos do rato amplamente disponíveis para citometria de fluxo, esta técnica pode ser usada para investigar não apenas proteínas da superfície celular, mas também fosfoproteínas intracelulares e citocinas, bem como leituras funcionais21. Aqui demonstramos como reagentes de citometria de fluxo podem ser usados para identificar subconjuntos de células B à medida que amadurecem e diferenciam em órgãos linfoides secundários. Após a otimização das condições de coloração, manuseio de amostras, configuração correta do instrumento e aquisição de dados e, finalmente, análise de dados, um protocolo para análise citométrica de fluxo abrangente do compartimento celular B em camundongos pode ser utilizado. Tal análise abrangente baseia-se em uma nomenclatura de décadas concebida por Hardy e colegas, onde o desenvolvimento de células BM B-2 pode ser dividido em diferentes frações (Fração) dependendo de sua expressão de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e IgD22. Hardy et al., mostraram que as células B220+ CD43 BM B podem ser subdivididas em quatro subconjuntos (Fração A-C') com base na expressão BP-1 e CD24 (30F1), enquanto as células B220+ CD43-(dim to neg) BM B podem ser resolvidas em três subconjuntos (Fração D-F) com base na expressão diferencial de IgD e IgM23 de superfície. A fração A (células pré-pró-B) são definidas como BP-1- CD24 (30F1)-, A fração B (células pro-B precoces) são definidas como BP-1- CD24 (30F1)+, Fração C (células pro-B tardias) são definidas como BP-1+ CD24 (30F1)+, e Fração C' (células pré-B precoces) são definidas como BP-1+ e CD24nenta. Além disso, as células Fração D (pré-B) são definidas como células B220+ CD43-IgM-B e Fração E (células B recém-geradas, combinação de imaturo e transitório) são definidas como células B220+ CD43- IgM+ B e Fraction F (células B maduras e recircuturas) são definidas como células B220high CD43- IgM+ B. Em contraste, a maioria das células B ingênuas encontradas no baço pode ser dividida em células B maduras (B220+ CD93-) e células transitórias (T1, T2, T3) dependendo da expressão de CÉLULAS CD93, CD23 e IgM. Células B maduras podem ser resolvidas em subconjuntos marginais e foliculares baseados na expressão de IgM e CD21/CD35, e subconjuntos foliculares podem ser ainda divididos em subconjuntos de células foliculares maduras tipo I e folicular tipo II B, dependendo do nível de sua expressão de superfície IgM e IgD24. Essas populações de células B esplênicas expressam predominantemente cadeia de luz Igκ. Finalmente, as populações de células B-1 B, que se originam no fígado fetal e são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural de camundongos adultos, foram descritas na literatura. Estas células B peritoneal podem ser distinguidas das células B-2 B descritas anteriormente pela falta de expressão CD23. Eles são então subdivididos em populações B-1a ou B-1b, com o primeiro definido pela presença de CD5 e o segundo por sua ausência25. Progenitores de células B-1 são abundantes no fígado fetal, mas não são encontrados em BM adulto. Enquanto as células B-1a e B-1b são originárias de diferentes progenitores, ambas semearam as cavidades peritoneal e pleural24. Em contraste com as células B-2, as células B-1 são exclusivamente capazes de auto-renovação e são responsáveis pela produção de anticorpos IgM naturais.
Defeitos no desenvolvimento celular B podem surgir em muitos casos, incluindo deficiências nos componentes do BCR26,27, perturbações de moléculas de sinalização que impactam a força de sinalização BCR14,28,29, ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular B30,31 . A análise da citometria de fluxo dos compartimentos linfoides contribuiu para a caracterização dos blocos de desenvolvimento de células B nesses camundongos e muitos outros. Uma vantagem da análise citométrica de fluxo dos compartimentos linfoides é que ele oferece a capacidade de fazer medições em células individuais obtidas a partir de tecido dissociado vivo. A disponibilidade de reagentes em uma gama cada vez maior de fluoroforos permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Além disso, a enumeração das células B por análise citométrica de fluxo complementa outros ensaios imunológicos, como métodos imunohistoquímicos que visualizam a localização celular dentro de órgãos linfoides, detecção de níveis de anticorpos circulantes como medida de imunidade humoral, bem como duas microscopia fótons para medir as respostas das células B no espaço real e no tempo32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22363611</td>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mM MACS SmartStrainer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-110-916&#160;</td>
			<td>70 mM cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U bottom plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td>GIBCO&#160;</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acroprep Advance 96 Well Filter Plate</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>8027</td>
			<td>filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-0452-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552844</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A8577</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-1</td>
			<td>BD</td>
			<td>740882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>566349</td>
			<td>brilliant stain buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD</td>
			<td>563168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21/35</td>
			<td>BD</td>
			<td>562756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>740216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 (HSA)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>138504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>561388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BD</td>
			<td>553270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5</td>
			<td>BD</td>
			<td>563194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BD</td>
			<td>740750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extended Fine Tip Transfer Pipette</td>
			<td>Samco</td>
			<td>233</td>
			<td>disposable transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSymphony A3 flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>custom order</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>Fc block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>automated dissociation tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td>tissue dissociator instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GR1 (Ly6C/6G)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-5790-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kappa</td>
			<td>BD</td>
			<td>550003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>407308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde, 32% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>426103</td>
			<td>monocyte blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575038</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>cell counter instrument&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric characterization of murine b cell development

Estudos extensivos caracterizaram o desenvolvimento e diferenciação de células murinas B em órgãos linfoides secundários. Anticorpos secretados por células B foram isolados e desenvolvidos em terapêutica bem estabelecida. A validação do desenvolvimento de células murinas B, no contexto de camundongos propensos a autoimunes, ou em camundongos com sistemas imunológicos modificados, é um componente crucial para desenvolver ou testar agentes terapêuticos em camundongos e é um uso apropriado da citometria de fluxo. Parâmetros citométricos de fluxo celular B bem estabelecidos podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de células B no peritônio murina, medula óssea e baço, mas uma série de melhores práticas devem ser aderidas. Além disso, a análise citométrica de fluxo dos compartimentos de células B também deve complementar leituras adicionais do desenvolvimento de células B. Os dados gerados usando essa técnica podem promover nossa compreensão de modelos de camundongos propensos a doenças, autoimunes, bem como camundongos humanizados que podem ser usados para gerar anticorpos ou moléculas semelhantes a anticorpos como terapêuticas.

Aqui apresentamos a estratégia de gating para caracterizar o desenvolvimento de células B no peritônio do rato, BM e baço. A base da análise é formada em torno do conceito de coloração com corante viável, em seguida, gating out doublets com base nas características de Forward-Scatter-Area (FSC-A) e Forward-Scatter-Height (FSC-H), e finalmente gating out detritos selecionando células de acordo com suas características FSC-A e Side-Scatter-Area (SSC-A), referidos aqui como o por...

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Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Os dados gerados com essa técnica promoveram a compreensão de modelos de camundongos propensos a autoimunes, bem como camundongos humanizados, que podem ser usados para terapêutica geral de anticorpos ou anticorpos. A disponibilidade de reagentes com uma gama cada vez maior de fluoroforos, permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros em células individuais e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados.para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. Oi, sou Faith Harris. Vou demonstrar o procedimento hoje.Comece aliquoting um milhão de cada tipo de célula de cada animal em uma placa de fundo U de 96 poços. Certifique-se de que poços suficientes estejam disponíveis para todas as amostras e controles, incluindo manchas completas, amostras de fluorescência-menos-uma e amostras não manchadas para cada fluoróforo. Para o painel de maturação da medula óssea e o painel de maturação do baço, as células de alíquota em dois poços, 1 milhão de células por poço para cada amostra completa de manchas.Para os controles de viabilidade de compensação de cores únicas, adicione dois milhões de células cada um de cada tipo de célula a poços individuais. Centrifugar a placa a 845 x g por dois minutos a quatro graus Celsius. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar os poços.Lave as células duas vezes em 200 microliters de DPBS. Centrifugar e decantar o sobrenante após cada lavagem. Resuspensar as células em 100 microliters de diluído em DPBS na proporção de um a 1000, evitando as células utilizadas para compensação de cor única.Para cada conjunto de manchas, deixe vários poços não manchados para uma amostra completamente não manchada e outros controles que você pode precisar, bem como um poço adicional não manchado para o controle fmo de viabilidade. Adicione PBS a esses poços. Resuspend as células de controles de viabilidade de compensação de cores únicas em 200 microliters de corante de viabilidade diluída.Transfira 100 microliters dessas células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e aqueça-o por cinco minutos a 65 graus Celsius, em seguida, transfira as células aquecidas de volta para o poço original com as células vivas restantes. Incubar as células a quatro graus Celsius por 30 minutos protegidos da luz. Após a incubação, centrifugar as células e decantar o supernante, piscando ou invertendo a placa sem contaminar os outros poços.Lave as células reutilizando em 200 microlitres de DPBS, depois centrífugas e decantam o supernatante como antes. Repita a lavagem dpbs novamente. Adicione microliters de bloco FC diluídos com tampão de manchas em uma proporção de 1 a 50 para obter uma concentração final de 10 microgramas por mililitro.Para células peritoneal, adicione cinco microliters de bloqueador de monócitos para reduzir a coloração inespecífica. Em seguida, incubar as células a quatro graus Celsius por 15 minutos, protegidas da luz. Prepare misturas completas de mestre de manchas e FMOs no tampão de manchas para um volume final de 100 microliters por milhão de células usando as tabelas de anticorpos no manuscrito do texto.Sem remover o bloco FC, adicione 100 microliters de misturas completas de manchas e FMOs aos poços selecionados. Prepare controles de compensação de cores únicas para cada anticorpo e um conjunto de manchas. Siga as instruções do fabricante se usar contas de compensação.Incubar as células e as contas a quatro graus Celsius por 30 minutos, protegidas da luz. Em seguida, centrífugas e decantar o supernatante invertendo e sacudindo a placa. Lave as células e as contas em 200 microliters de tampão de manchas três vezes, centrifugando e decantando o supernatante todas as vezes.Resuspende as células e contas em 200 microlitres de 2% paraformaldeído em DPBS para fixar as amostras para análise. Incubar a célula e as contas a quatro graus Celsius por 30 minutos, protegidos da luz, depois centrífugas e decantar o supernatante invertendo ou sacudindo a placa. Resuspenja as células e contas em 200 microliters de tampão de manchas.Coloque uma placa de filtro sobre uma placa de fundo U limpa de 96 poços e transfira cada amostra para um poço da placa do filtro usando uma multi-pipeta. Centrifugar a placa do filtro e decantar o supernante. Para os painéis de maturação de medula óssea e baço, resuspenja as células totalmente manchadas em 100 microliters de tampão de manchas.Combine os dois poços para cada animal em um poço. Resuspenque os painéis restantes, FMOs e controles em 200 microliters de tampão de manchas. Incubar células fixas e contas a quatro graus Celsius durante a noite, protegidas da luz.Regiscões de compensação recorde para cada painel de manchas usando as compensações de manchas únicas preparadas e definir portões positivos e negativos para cada amostra. Calcule a matriz de compensação usando o software. Comece a adquirir a primeira amostra, certificando-se de que os portões estejam definidos adequadamente.Defina a máquina para executar e registrar os vários eventos celulares para cada amostra, conforme mencionado no manuscrito do texto. Proceder com a análise de dados utilizando o software de análise de citometria de fluxo, seguindo as estratégias de gating no manuscrito do texto. A análise citométrica de fluxo para caracterização de células B peritônios no peritônio mostra as frequências de células peritoneais viáveis, células B totais, subconjuntos B-1 e B-2, bem como células B-1a e B-1b em camundongos.Quando as células B da medula óssea foram analisadas, foram determinadas frequências de células viáveis, células B totais, fração A, células pré-pró-B, Fração B, Fração C, Fração C'Fração D, Fração Imatura E, Fração E transitória e fração F B em camundongos. A análise das células B esplênicas mostra as frequências de células de baço viáveis, células B totais, células B transitórias, células T1, T2, T3, células B maduras, células I foliculares, células foliculares II, células precursoras e maduras da zona marginal, e células B-1 em camundongos. As frequências de células kappa de imunoglobulina e imunoglobulina lambda B em camundongos foram determinadas com análise citométrica de fluxo do baço.Ao executar este protocolo, você precisa resolver o sinal de um detector sangrando para o próximo usando controles de compensação. Esses controles podem ser manchados de células ou com contas de compensação disponíveis comercialmente. Ensaios adicionais podem ser usados em conjunto com a citometria de fluxo, como a imunohistoquímica para visualizar a localização celular dentro de órgãos linfoides, bem como duas microscopia de fótons para analisar as respostas das células B em espaço e tempo reais.A análise da citometria de fluxo dos compartimentos celulares B permite a caracterização de fenótipos associados à RBC e deficiências relacionadas, perturbações de moléculas de sinalização BCR ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular B.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...