Name: dynamic measurement and imaging of capillaries, arterioles, and pericytes in mouse heart
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por el Centro de Ingeniería y Tecnología Biomédica (BioMET); NIH (1U01HL116321) y (1R01HL142290) y la Asociación Americana del Corazón 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Todo el cuidado de los animales fue de acuerdo con las directrices de la Universidad de Maryland Baltimore y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó protocolos.
1. Preparación de las soluciones
NOTA: Preparar soluciones con antelación. Dos tipos de soluciones básicas se utilizan en los experimentos: (1) soluciones salinas fisiológicas (PSS) para superfusato de baño y (2) soluciones de Tirorode para perfusato de lúmenes. Se necesita un burbu...

<ol>
	<li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart.">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li><li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart.">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li><li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle.">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li><li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply.">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li><li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques.">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li><li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level.">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li><li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation.">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li><li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents,+Ca2++signals,+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries.">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li><li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1+enhances+SR+Ca2++content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes.">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li><li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion.">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li><li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology.">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li></ol>

En el presente trabajo, hemos introducido un método ex vivo notablemente simple pero altamente práctico para estudiar la microcirculación coronaria en el corazón en condiciones fisiológicas. Este método fue modificado a partir de investigaciones mecánicas utilizando ratas2. La adición desafiante fue la tecnología de imágenes con alta velocidad y alta resolución óptica. Por lo tanto, pudimos aprovechar los avanzados sistemas de imágenes ópticas que ahora están disponibles comercialme...

La regulación adecuada del flujo de presión coronaria asegura suficiente suministro de sangre al corazón para satisfacer sus demandas metabólicas1. Sin embargo, recientemente ha quedado claro cómo el flujo de presión coronario está regulado dinámicamente en el corazón, a pesar de los extensos estudios que se han realizado in vivo e in vitro durante las últimas décadas. Una de las razones es la dificultad de establecer un modelo de trabajo fisiológico para este tipo de estudios debido a la latido constante del corazón. A pesar de todo, se han establecido una variedad de métodos para la observación de los micro-vasos coronarios en tejidos vivos o animales, pero ninguno de estos métodos fue capaz de lograr un enfoque constante / estable y las mediciones de la presión, flujo y diámetro microvascular al mismo tiempo2,3. La visualización directa de micro-vasos arteriales coronarios en el corazón latiendo se introdujo hace décadas4,3,pero las mediciones de diámetro en recipientes pequeños fue un desafío y las funciones específicas de los muchos tipos de células especializadas asociadas con la microcirculación fueron igualmente molestas. Incluso el método estroboscópico y el sistema objetivo flotante no podían proporcionar la información anterior simultáneamente5. No obstante, se ha obtenido una cantidad significativa de información valiosa utilizando las tecnologías antes mencionadas, que nos han ayudado a comprender más sobre la regulación del flujo sanguíneo coronario6. El método que estamos describiendo en este artículo ayudará a investigar y entender en detalle cómo los componentes de las arterias coronarias, las arterias y la microvasculatura responden de manera diferente a las estimulaciones y demandas metabólicas.
El modelo de trabajo que establecimos para llevar a cabo estos estudios se construyó sobre el trabajo anterior de Westerhof et al.2. Después de la canulación de la arteria septal del corazón del ratón, se utilizó solución salina fisiológica para perfundir esa arteria para mantener nutridos los micocitos y otros componentes del tejido cardíaco. La presión arterial por perfusión, el flujo y el diámetro vascular fueron monitoreados entre otras funciones fisiológicas utilizando indicadores fluorescentes apropiados. Este método nos permite visualizar el lecho microvascular coronario bajo presión fisiológica en el tejido vivo y estudiar por primera vez los mecanismos celulares subyacentes a la regulación de la microcirculación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxoScope software</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller/water incubator</td>
			<td>FisherScientific, USA</td>
			<td>Isotemp 3016S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Nikon Instruments, USA</td>
			<td>A1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom glass tubing</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1322A</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution Heater</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, Idaho, USA</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette/cannula holder</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>64-0981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2DsRedBAC transgenic mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#008241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread for tying blood vessels</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>THR-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td>
			<td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic measurement and imaging of capillaries, arterioles, and pericytes in mouse heart

El tono arterial coronario junto con la apertura o cierre de los capilares determinan en gran medida el flujo sanguíneo a los cardiomiocitos a presión constante de perfusión. Sin embargo, es difícil monitorear los cambios dinámicos de las arterias coronarias y los capilares en todo el corazón, principalmente debido a su movimiento y latido sin parar. Aquí describimos un método que permite monitorear la tasa de perfusión arterial, la presión y los cambios de diámetro de las arterias y capilares en los músculos papilares ventriculares derecho del ratón. La arteria septal del ratón se puede acumular y perfundir a un flujo o presión constante con la otra medida dinámica. Después de perfusión con una lectina etiquetada fluorescentemente (por ejemplo, Alexa Fluor-488 o -633 etiquetada Wheat-Germ Agglutinin, WGA), las arterias y capilares (y otros vasos) en el músculo papilar ventrículo derecho y el tabique podrían ser fácilmente imaginedos. Los cambios en el diámetro de los vasos podrían medirse en presencia o ausencia de contracciones cardíacas. Cuando se expresaron proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, se pudieron monitorear características específicas. Por ejemplo, los pericitos se visualizaron en corazones de ratón que expresaban NG2-DsRed. Este método ha proporcionado una plataforma útil para estudiar las funciones fisiológicas de los pericitos capilares en el corazón. También es adecuado para estudiar el efecto de los reactivos en el flujo sanguíneo en el corazón mediante la medición del diámetro vascular / capilar y la presión luminal arterial simultáneamente. Esta preparación, combinada con un sistema de imágenes ópticas de última generación, permite estudiar el flujo sanguíneo y su control a nivel celular y molecular en el corazón en condiciones casi fisiológicas.

Cuando un marcador vascular de fluorescencia se perfunde en lúmenes vasculares (aquí WGA conjugado con Alexa Fluor-488), es posible visualizar árboles vasculares enteros como se muestra en la Figura 5 (panel izquierdo) utilizando microscopio confocal de alta velocidad. Una mayor ampliación permite la toma de imágenes de capilar en detalle(Figura 5,Panel derecho). Dado que el sistema presurizado admite un monitoreo constante de la presión luminal, esta prep...

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Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

This method can be used to study coronary microcirculation in living murine heart tissue and vascular-tree components by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow. This method provides a useful platform for studying the function of pericytes and reagents microcirculation within the heart, by so we tend measuring the vascular diameter and arteriole luminal pressure. To prepare a cannula for the experiment, use a micropipette puller to produce two cannulae with long thin tips, from a single clean borosilicate glass tube.Use a fine pair of scissors and a dissecting microscope to cut the tip of each cannula to a final tip diameter of 100 to 150 micrometers, and fire polish the tips to slightly round the sharp edges. Use a platinum wire positioned on the side of the shaft, approximately two millimeters from the tip to bend the cannula along the shaft to an about 45-degree angle, and insert the open end of the cannula into the cannula holder. Then, tighten the fitting, and use a five milliliter syringe to flush the cannula and tubing with Tyrode's solution.Mount the cannula holder onto micro-manipulation of a pressure myograph chamber. To collect a mouse heart for the experiment, first enter a pair in it inject 500 microliters of heparin into an anesthetized eight to 16-week-old C 57 black six mouse. After 10 minutes, place the mouse onto a heated bed in the supine position, and stabilize the paws with labeling tape.Use forceps and surgical scissors to make an incision in the abdominal skin, above the diaphragm and cut the diaphragm and the sternum to allow dissection of the heart from the thoracic cavity. Place the heart into ice cold Tyrode's solution containing 30 millimolar BDM and remove any connective tissues from the heart as necessary. Then place the heart into a pre-chilled dissecting chamber, filled with fresh Tyrode's solution supplemented with 30 millimolar BDM.To prepare the septal artery for cannulation, turn on the servo pomp, and set the servo controller pressure to flow mode. In the heart onto the PDMS, taking care to avoid damage to the middle area of the tissue and place the tissue under a dissecting microscope. Remove one or both atria, and cut open the right ventricle.Remove the right ventricular free wall and expose the septal artery. Use a 30 micrometer diameter nylon thread to tie a loose knot around the septal artery. Use fine scissors to remove the left ventricular free wall and transfer the papillary muscle preparation to the experimental chamber.Use a micro manipulator to insert a cannula into the septal artery and secure the cannula with the suture. Then use pins to secure the papillary muscle to the chamber floor with the tip of the cannula parallel to the arterial wall, so that a clear view of the vasculature can be obtained and use the syringe to gradually flush the solution through the cannula. To stabilize the tissue preparation, turn on a peristaltic pump and continuously super fuse the preparation with pre-gassed physiological saline solution at a three to four milliliters per minute flow rate, turn on the temperature controller for the superfusion solution, and adjust the temperature of the bath superfusate to 35 to 37 degrees Celsius.Connect the cannula to the servo pump and adjust the flow to set the pressure to approximately 10 millimeters of mercury. Let the superfusion run for about 10 minutes, then increase the flow of the luminal solution to set the artery pressure to approximately 60 millimeters of mercury and allow the sample to stabilize for 30 to 60 minutes with monitoring. To load the sample with wheat-germ agglutinin, perfuse the preparation with five milliliters of Tyrode's solution, supplemented with 100 micrograms of Alexa Fluor-488 Conjugated Wheat-Germ Agglutinin.After 30 minutes, change the perfuse aid back to normal Tyrode's solution and turn on the confocal microscope system. Use the microscope at a lower power of magnification, to locate the septal artery in transmitted light mode, and begin imaging with this spinning disc confocal. Select a 40X objective magnification, and the 488 nanometer excitation laser, and adjust the laser intensity and the sampling rate.To define the imaging range, set the top and bottom imaging positions for the microscope and set the step size and Z-stack imaging parameters. Then, select a folder for storing the image and click run to begin recording the images. When a fluorescence vascular marker is perfused into the vascular lumen, it's possible to visualize whole vascular trees, using high-speed confocal microscopy.Further magnification enables imaging of the capillary in detail. When pinacidil and ATP sensitive potassium channel agonist is served from the lumen, the diameter of the arterials increases. When the vasoconstrictor endothelin one is applied from the lumen.The diameter of the arterial decreases. When the flow set is constant, the luminal pressure increases. In these images of papillary tissue from an NG two DS red expressing transgenic mouse, both the capillary and pericytes can be visualized within the papillary muscle tissue, under conditions that better mimic the physiology of live animals.It's important that no bubbles are present within the tubing at any point during the procedure. Combining this method with optical imaging techniques, the preparation can be used to study microcirculation in the heart and intercellular communications between different cell types, using fluorescence tech transgenic mice.

Research

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