גישה לחקר תעתיק תלוי צורה ברמת תא יחיד

אנו מציעים פלטפורמה חדשנית לחקירת ההשפעות של צורת התא על ביטוי גנים, תוך שימוש בשיטות לגידול ומיון דבקויות עם מורפולוגיות שונות ברמת התא הבודד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על מחקר תפוקה גבוהה של צורת התא במבחנה כמו השוואת תאים עם צורות שונות ב vivo הוא תובעני מבחינה טכנית. כדי להקים תרבות cardiomyocyte בדוגמת, להעביר השעיה cardiomyocyte ביחס גובה-רוחב של עניין צינור 15 מיליליטר לספירה ולדלל את התאים ל 10 פעמים עד חמשת התאים למיליליטר של ריכוז בינוני ציפוי מתאים.

הוסיפו שני מיליליטר תאים לשבב מיקרו-פטרוני מצופה פיברונקטין שקוע בשני מיליליטר של מדיום ציפוי חם בתוך צלחת גרנייה פטרי 35 מיליליטר והניחו את המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 18 שעות. למחרת, בדוק את השבב על ידי מיקרוסקופ אור כדי לאשר שרוב התאים מחוברים. מוציאים את המדיום מהצלחת כדי להסיר את כל הפסולת או התאים המתים, ומתחילים מהמרכז ומתקדם לכיוון הצדדים בצורה טיפה חכם, בעדינות להוסיף PBS לתאים.

לאחר הכביסה השלישית, החלף את ה- PBS במדיום תחזוקה של ארבעה מיליליטר והחזר את התאים לאנקובטור תרבות התאים. לאחר 72 שעות, יש לשטוף בעדינות את משטח השבב פעמיים עם שני מיליליטר של PBS חם של Dulbecco לכל שטיפה כפי שהוכח ולהשתמש במטליות כדי להעביר מיד את השבב השטף למנה סטרילית חדשה של 35 מיליליטר גרנייה פטרי. הוסף במהירות 1.5 מיקרוליטרים של ירוק דיסיקל תוסס מדולל 1000 לקפל DPBS לשבב.

מתקנים תא מעל השבב ומ מניחים את המנה על מחזיק הכלים של שלב בורר התאים. הכנס את המכסה המגנטי ואתר את הכוונת בחלון התצוגה החיה. התמקד בצלב, ובחלון הסריקה והמיון, בחר את הכיול להזרקה וכיול אוטומטיים.

החלף את המנה supernatant עם 1.5 מיליליטר של E משולש אחד לאחד בפתרון DPBS כדי לשחרר את התאים מן fibronectin ולפתוח את לשונית הסריקה. כדי לסרוק את השבב כולו, התמקד בפינה השמאלית העליונה של השבב בשדה התצוגה ולחץ על קבל את מיקום המיקרוסקופ הנוכחי. לאחר מכן, התמקד בפינה השמאלית התחתונה של השבב ולחץ על קבל את מיקום המיקרוסקופ הנוכחי.

בחלון המוקפץ, לחץ על הגדר את המישור החד ביותר ולחץ על מעבר לפינה השמאלית העליונה ולעבור ללחצני הפינה הימנית התחתונה. לאחר מכן, לחץ על סיום כדי להתחיל בסריקה. לאחר השלמת הסריקה, פתח את הכרטיסיה ניתוח ולחץ על הצג מפה כדי לבחור את התאים הבודדים העוברים את קריטריוני המחקר.

מרכז את מיקרו-הכיפה של הזכוכית באמצע הנוף החי של המיקרוסקופ ופתח את לשונית המשאבה. כדי ליצור ואקום, לסגת הבוכנה מ 50 מיליליטר מספר אחד מזרק ארבעה מיליליטר ולפתוח את לשונית המיון. כדי לאפשר תא בודד להיאסף, הגדר את השסתום 2 להיפתח במשך 120 אלפיות שנייה ושסתום אחד להיפתח במשך 20 אלפיות שנייה לאחר זמן לשגות של 200 אלפיות שנייה.

כדי לאפשר את התא הרים להישלח בהצלחה לצינור PCR שלה המכיל מאגר תזה, להגדיר את השסתום אחד להיפתח במשך 20 אלפיות שנייה שסתום שתיים להיפתח במשך 10 אלפיות שנייה לאחר זמן לשגות של 10 אלפיות השניה. לאחר התאמת הגדרות השסתום, לחץ על מ לחשב את הנתיב. התוכנה ת לחשב את הנתיב המהיר ביותר מתא לתא להרים והזרקת התאים שנבחרו לאורך השבב.

לאחר מכן, למקד את המיקרוסקופ על דפוס על פני השטח של השבב. השתמשו בהיגוי כדי להזיז את המיקרו-אקפילארי כלפי מטה בזהירות, כך שניתן יהיה להשיג את התמונה החדה ביותר של קצה המיקרו-אקפילארי מבלי לגעת במשטח השבב וללחוץ על סט. ייפתח חלון חדש, המציג את חתך המיקרו-אקפילארי.

כדי שהתוכנה תקליט את היסט הקצה של נימי הקואורדינטות X, Y ו- Z, לחץ על המרכז המדויק של נימי. לאחר מכן, לחץ על התחל למיין כדי להפעיל את המיון. בניתוח מייצג זה של cDNA מוגבר מראש מתא בודד הרים, רצועה ברורה בג'ל כמו עלילה densitometry נצפתה המתאימה לשיא ב 1, 852 זוגות בסיס ב electropherogram.

הגודל הממוצע של שברים היה 1, 588 זוגות בסיס עם מספר קטן של שברים שהיו קצרים יותר מ 300 זוגות בסיס, המציין את הדור של ספריית cDNA טובה. כתמים וניתוח Immunofluorescent יכול להתבצע גם כדי להעריך את מבנה sarcomere בתוך cardiomyocytes בדוגמת. פלטפורמה זו סוללת את הדרך לחקר תפוקה גבוהה הקרנת סמים של סוגים שונים של אי ספיקת לב.