Vi föreslår en ny plattform för att undersöka effekterna av cellform på genuttryck, med metoder för odling och sortering av följningar med olika morfologier på singelcellsnivå. Den största fördelen med denna teknik är att det underlättar den höga genomströmningsstudien av cellform in vitro som att jämföra celler med olika former in vivo är tekniskt krävande. För att inrätta en mönstrad kardiomycytkultur, överför en kardiomyocyte suspension vid bildförhållandet av intresse till en 15 milliliter rör för att räkna och späda ut cellerna till en en gånger 10 till de fem cellerna per milliliter av lämplig plätering medium koncentration.
Tillsätt två milliliter celler på en fibronectin bestruket mikromönster chip nedsänkt i två milliliter varm plätering medium inuti en 35 milliliter Grenier Petri skålen och placera skålen i en 37 grader Celsius och 5% koldioxid inkubator i 18 timmar. Nästa dag, kontrollera chipet med lätt mikroskopi för att bekräfta att de flesta av cellerna har fäst. Ta bort mediet från skålen för att ta bort skräp och eller döda celler, och med början från mitten och rör sig mot sidorna på ett droppvis sätt, försiktigt lägga PBS till cellerna.
Efter den tredje tvätten, byt ut PBS med fyra milliliter underhållsmedium och returnera cellerna till cellodlingen inkubatorn. Efter 72 timmar, spola försiktigt spånytan två gånger med två milliliter varm Dulbeccos PBS per tvätt som demonstreras och använd forceps för att omedelbart överföra det tvättade chipet till en ny steril 35 milliliter Grenier Petri-skål. Tillsätt snabbt 1,5 mikroliter av levande dicycle grön utspädd 1000 gånger i DPBS till chipet.
Fixa en kammare över chipet och placera skålen på skålen innehavaren av cellplockaren scenen. Sätt i magnetlocket och lokalisera hårkorset i livevisningsfönstret. Fokusera på hårkorset och, i skannings- och sorteringsfönstret, välj kalibreringen för automatiserad injektion och kalibrera.
Ersätt skålen supernatant med 1,5 milliliter av en en-till-en trippel E i DPBS-lösning för att lossa cellerna från fibronectin och öppna skanningsfliken. För att skanna hela chip, fokusera på det övre vänstra hörnet av chipet i synfältet och klicka på Få aktuella mikroskop position. Därefter fokusera på nedre högra hörnet av chip och klicka få aktuell mikroskop position.
I popup-fönstret klickar du på Ställ skarpaste plan och klickar på Gå till övre högra och gå till den nedre vänstra hörnet knappar. Klicka sedan på Slutför för att börja skanna. När skanningen är klar öppnar du analysfliken och klickar på Visa karta för att välja de enstaka celler som klarar studiekriterierna.
Centrera glaset mikrokapillär i mitten av mikroskopet live view och öppna pumpen fliken. För att skapa ett vakuum, dra tillbaka kolven från en 50 milliliter nummer ett spruta fyra milliliter och öppna sorteringsfliken. För att en enda cell ska kunna plockas, ställ in ventilen två som ska öppnas för 120 millisekunder och ventil en som ska öppnas för 20 millisekunder efter en time-lapse av 200 millisekunder.
För att låta den plockade cellen levereras framgångsrikt till sitt PCR-rör som innehåller lysbuffert, ställ in ventilen en som ska öppnas för 20 millisekunder och ventil två som ska öppnas i 10 millisekunder efter en time-lapse av 10 millisekunder. När ventilinställningarna har justerats klickar du på beräkning av sökvägen. Programvaran kommer att beräkna den snabbaste vägen från cell till cell för att plocka upp och injicera de valda cellerna i hela chipet.
Fokusera sedan mikroskopet på ett mönster på spånytan. Använd joysticken för att flytta ner mikrokapillären försiktigt så att den skarpaste bilden av toppen av mikrokapillären kan erhållas utan att röra spånytan och klicka på set. Ett nytt fönster kommer att öppnas, som visar mikrokapillär tvärsnitt.
För att få programvaran att registrera spetsen förskjutning av kapillären i koordinaterna X, Y och Z, klicka på den exakta mitten av kapillären. Klicka sedan på starta sortering för att starta sorteringen. I denna representativa analys av förförstärkt cDNA från en plockad enda cell, observerades ett klart band i gelen som densitometri plot motsvarar toppen på 1, 852 baspar i elektroferogrammet.
Den genomsnittliga storleken på fragment var 1, 588 baspar med ett litet antal fragment som var kortare än 300 baspar, vilket indikerar generering av ett bra cDNA-bibliotek. Immunofluorescerande färgning och analys kan också utföras för att utvärdera sarkomerstrukturen inom de mönstrade kardiomyocyterna. Denna plattform banar väg för hög genomströmning studie och drogscreening av olika typer av hjärtsvikt.
