Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFC1103704)، ومؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (JCYJ2017081717216272)، والصناديق الخاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)، مشروع سانمينغ للطب في شنتشن (SZSM201412020)، صندوق بناء الانضباط الطبي عالي المستوى في شنتشن (2016031638)، مؤسسة شنتشن لهيئة الصحة وتنظيم الأسرة (SZXJ2017021 ، SZXJ2018059).

وقد اجريت جميع التجارب وفقا للاسوجية واللوائح ذات الصلة لمجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى شنتشن الشعبى الثانى ، المستشفى الاول التابع لجامعة شنتشن .
1. تصميم porcine التمهيدي محددة
<ol><li>إجراء تحليل الانفجار الجينوم الكامل لتحديد الجينات محددة porcine التي كانت مختلفة عن البشر أو ا...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

يمثل قياس الحمض النووي المُتداول في البورcine نهجًا عمليًا لرصد الرفض المناعي لمعالجة زراعة الزان. وجد غادي وآخرون24 أن محتوى الحمض النووي المتداول المشتق من المانحين (DdcfDNA) في دم المرضى الذين يعانون من الرفض الحاد كان أعلى بكثير من محتوى المرضى الذين لا ينفضون. وتشير هذه الدراس?...

فشل الجهاز هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة1. زرع الخلايا والأنسجة والأعضاء هو وسيلة فعالة لعلاج فشل الجهاز2. ومع ذلك، فإن نقص الأعضاء المانحة يحد من التطبيق السريري لهذه الطريقة3،4. وقد أظهرت الدراسات أن الخنازير يمكن استخدامها كمصدر محتمل للأعضاء البشرية لزرع السريرية5,6. ومع ذلك ، فإن زرع الأعضاء عبر الأنواع يواجه رفضًا مناعيًا خطيرًا. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لرصد رفض المناعة من زراعة xenotransation. حاليا، الرصد السريري للرفض المناعي يعتمد أساسا على علامات المريض وأعراضه، فضلا عن الاختبارات المخبرية (على سبيل المثال، خزعة، التحليل المناعي الكيميائي، والموجات فوق الصوتية)7،8،9. ومع ذلك، هذه الطرق الرصد لها العديد من العيوب. عادة ما تظهر علامات وأعراض الرفض المناعي في المرضى المتأخرين10، وهو أمر لا يؤدي إلى الكشف المبكر والتدخل المبكر ؛ خزعة لديه عيب يجري الغازية11، والتي ليس من السهل على المرضى لقبول; يفتقر التحليل المناعي الكيميائي إلى الحساسية أو التحديد ، والموجات فوق الصوتية هي مساعدة ومكلفة. لذلك ، من الملح العثور على طريقة فعالة ومريحة لمراقبة الرفض المناعي.
الحمض النووي المتداول هو نوع خارج الخلية من الحمض النووي وجدت في الدم. ماندل وميتايس12 أول من أبلغ عن وجود الحمض النووي المتداول في الدم المحيطي في عام 1948. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، فإن الحمض النووي المتداول في دم الأشخاص الأصحاء منخفض نسبيًا عند خط الأساس. ومع ذلك ، في بعض الأمراض ، مثل الأورام ، احتشاء عضلة القلب ، أمراض المناعة الذاتية ، ورفض الزراعة ، يمكن زيادة مستوى الحمض النووي المتداول في الدم بشكل كبير13،14 بسبب الإطلاق الهائل للحمض النووي المتداول الناجم عن موت الخلايا المبرمجة والناخر. ويرتبط أصل الحمض النووي المتداول مع المبرمج والناخر15، والتي هي سمة من الرفض xenograft16.
وقد ثبت أن الحمض النووي المتداولة هي علامة حيوية طفيفة التوغل للكشف عن السرطانات17,18,19. عالية من خلال وضع تسلسل من المانحة المستمدة من الحمض النووي المتداولة موثوق بها للكشف عن الرفض بعد زرع الأعضاء20,21. ومع ذلك، تتطلب هذه الطريقة تركيزًا عاليًا وجودة الحمض النووي المستخرج. متطلبات الحمض النووي بالإضافة إلى التكلفة العالية واستهلاك الوقت تجعل هذه الطريقة غير مؤهلة للاستخدام السريري الروتيني. يمكن تحديد الحمض النووي المتداول المشتق من المانحين بدقة بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي ( qPCR ) ، وهو محدد وحساس على حد سواء. ولذلك، فإن قياس الحمض النووي المُوزّع بالحمض النووي المُوزّع بالحمض النووي من خلال qPCR هو طريقة مجدية لرصد الرفض المناعي لمعالجة زراعة الزان. هذا أقل الغازية، حساسة للغاية ومحددة، وانخفاض التكلفة، وتوفير الوقت. الخنازير والبشر منفصلة وراثيا مع تسلسل الجينوم مختلفة تماما (الشكل 1). ولذلك، يمكن أن يطلق الحمض النووي porcine تعميم في دم المتلقي بعد xenotransplantation بسبب xeno-رفض. ويمكن تحديد قنينة اخصائية اخصائية محددة بدقة بواسطة qPCR مع ال التمهيديات الخاصة بالأنواع في دم المتلقي. سابقا ، لقد أظهرنا الأساس المنطقي والجدوى من cpsDNA باعتبارها علامة بيولوجية لxenotransplantation22،23. هنا، ونحن نكشف المزيد من النصائح والتفاصيل التجريبية. تتكون التجربة من الخطوات التالية. أولاً، تم تصميم الورم الأوليات الخاصة بالبورسين، وعزل الحمض النووي الجينومي، الذي استخدم للتحقق من خصوصية الـ PRIMERS من قبل PCR العادية. ثانيا ، بناء منحنى القياسية من cpsDNA وعزل cpsDNA من عينة الدم. وأخيراً، تم تحديد كمية الحمض النووي الخاص بخنزير المتداولة باستخدام qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

زراعة Xenotransplantation هي طريقة مجدية لعلاج فشل الجهاز. ومع ذلك، كيفية مراقبة فعالة رفض المناعة من زراعة xenotransation مشكلة للأطباء والباحثين. تصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة وفعالة لمراقبة الرفض المناعي في نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر ونماذج زرع ترقع الشريان من الخنزير إلى القرد. الحمض النووي المتداول هو علامة حيوية غير الغازية المحتملة لتلف الأعضاء. في هذه الدراسة، تم رصد الحمض النووي الخاص بالخنزير (CPsDNA) أثناء رفض xenograft بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR). وفي هذا البروتوكول، صُممت شظايا أحماض البورسين المحددة، وأنشئت شظايا محددة من البورسين تحتوي على البلازميدات، ووضعت منحنيات قياسية للكمية. ثم تم استخدام القرائية الخاصة بالأنواع لتحديد cpsDNA بواسطة qPCR في نماذج زراعة الخلايا من الخنزير إلى الفأر ونماذج زرع ترقع الشريان من الخنزير إلى القرد. تشير قيمة هذه الطريقة إلى أنه يمكن استخدامها كطريقة بسيطة ومريحة ومنخفضة التكلفة وأقل توغلًا لمراقبة الرفض المناعي لمعالجة زراعة الخلايا.

وفي هذا البروتوكول، صُممت أقواس أولية محددة من البورسين، وشيدت شظايا محددة من البورسين تحتوي على البلازميدات، وأنشئت منحنيات قياسية للكمية(الشكل 4). وقد أكدت PCR خصوصيات الأنواع في الـ 19 من ال التمهيديات. ثم استخدمت التمهيديات الخاصة بالأنواع (#4 التمهيدي واوبراي #11) لقياس cpsD...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

وفي هذا البروتوكول، صُممت شظايا أحماض البورسين المحددة، وأنشئت شظايا محددة من البورسين تحتوي على البلازميدات، ووضعت منحنيات قياسية للكمية. باستخدام ال التمهيديات الخاصة بالأنواع ، تم تحديد حجم cpsDNA بواسطة qPCR في نماذج زراعة الخلايا من الخنزير إلى الفأر ونماذج زرع ترقع الشريان من الخنزير إلى القرد.

القياس الكمي للحمض النووي الخاص بالخنزير في الدم لنموذج زراعة Xenotransplantation

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantation هو وسيلة مجدية لعلاج ومع ذلك ، الرصد الفعال للرفض المناعي للxenotransplantation هو مشكلة للأطباء والباحثين. هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة ومريحة ومنخفضة التكلفة وأقل الغازية لرصد رفض المناعة من xenotransmutation. ويمكن استخدام هذه التقنية في مجال زراعة النباتات، بما في ذلك زرع الجزر من الخنزير إلى الإنسان، وزرع الكلى، وزرع الكبد، وزرع القلب.تبدأ عن طريق نقل 500 ميكرولترات من عينات الدم إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المختلفة. إضافة 20 ميكرولتررس من protease K و 500 ميكرولترات من عازلة تحلل في الأنابيب. ثم يهز لهم جيدا لخلط.وضع الأنابيب في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تهز لهم مرتين إلى ثلاث مرات أثناء الحضانة حتى يصبح الحل الطرد المركزي واضحة لهم لفترة وجيزة لإزالة الخرز السائل من الجدار الداخلي لأغطية الأنبوب. ثم إضافة 500 ميكرولترات من اللامائية، الكحول الإيثيل، ويهز جيدا. نقل الخليط إلى عمود الامتزاز.ثم الطرد المركزي العمود لمدة دقيقتين والتخلص من السائل النفايات. إضافة 800 ميكرولترات من محلول شطف لكل عمود الامتزاز، والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة. ترك الأعمدة في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق لتجفيف محلول الشطف المتبقي.نقل أعمدة الامتصاص إلى أنبوب طردي مركزي نظيف. إضافة 50 ميكرولترات من عازلة elution إلى منتصف الأفلام الامتزاز ووضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق، ثم الطرد المركزي لهم لمدة دقيقة واحدة. إعداد المزيج الرئيسي PCR وفقا لاتجاهات المخطوطات، ثم إضافة 23 ميكرولترات من المزيج في كل أنبوب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة 0.6 ملليلتر.إضافة اثنين microliters من الحمض النووي الجينومي إلى كل أنبوب وكابوت بعناية. ثم مزيج لفترة وجيزة والطرد المركزي. ضع الأنابيب في دورة PCR وابدأ التضخيم.عندما يتم الانتهاء من رد الفعل أداء Agarose الكهرباء. أضف 1.2 غرام من أغاروز في قارورة تحتوي على مائة ملليمتر من TAE واغليها لمدة خمس دقائق في الميكروويف. مرة واحدة وقد هدأت Agarose إلى ما يقرب من 70 درجة مئوية، إضافة خمسة ميكرولترات من صبغة حمض نووي في القارورة، ببطء، صب في لوحة وتركها في درجة حرارة الغرفة حتى يتجمد في هلام.إضافة خمسة ميكرولترات من كل عينة وسلم الحمض النووي 2-Log أو علامة الحمض النووي 1، في آبار جل أغاروز والكهربية في 120 مليون رصيف حتى يتم فصل العصابات. تصور الجل مع التصوير فوق البنفسجي. بعد إجراء التحول كما هو موضح في مخطوطة النص، تحقق من البلازميدات بواسطة مضاعفة تقييد الهضم الإنزيم مع EcoR I و بام HI. فصل المنتجات المهضمة مع 1٪ Agarose electrophoresis وفضح الجل لضوء الأشعة فوق البنفسجية.تمييع البلازميد المركز مع جزء من الحمض النووي porcine إلى مرتين 10 إلى 11th نسخ لكل ملليلتر للمحلول القياسي البداية، وذلك باستخدام الماء المقطر مزدوجة. لإنشاء منحنى قياسي، قم بإعداد مزيج رئيسي qPCR، كما هو موضح في مخطوطة النص وإضافة 40 ميكرولترات من المزيج في كل أنبوب من شريط ثمانية أنابيب. إضافة 10 ميكرولترات من الحمض النووي القياسية من تركيزات مختلفة، وغطاء الأنابيب ثم خلط لفترة وجيزة والطرد المركزي لهم.ضع الأنابيب في جهاز qPCR واجري التضخيم. استخدام أنابيب EDTA لجمع عينات الدم من حوالي 400 ميكرولترات من نماذج التصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد، أو 100 ميكرولترات من نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر. ثم نقل العينات إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.إزالة خلايا الدم من عينات الدم عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة منخفضة وسرعة عالية. نقل المُندفع إلى أنبوب جديد للطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر، ثم قم بإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 16000 مرة من G لمدة 10 دقائق. نقل المابير إلى أنبوب جديد للطرد المركزي 1.5 ملليلتر واستخراج الحمض النووي المتداول باستخدام مصل تجاري أثناء تعميم عدة استخراج الحمض النووي.تكثيف حجم الحمض النووي المتداول إلى 40 ميكرولترات وتخزينها في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية. تنفيذ qPCR لتحديد كمية الحمض النووي المتداولة الخاصة الخنزير. تم تصميم القرائية الخاصة ببورسين واستخدامها لتحديد الحمض النووي الخاص بخنزير الانتشار بواسطة qPCR ، في نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر وتصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد ، ونماذج الزرع.تم استخدام الكهرباء Agarose لعزل شظايا الحمض النووي المضخمة. وباستخدام PCR، تم تحديد الـ التمهيدي الخاص بالحمض النووي الجينومي المسامي المكبر. بعد ذلك ، تم تأكيد خصوصيات الأنواع من هذه الزهية في مجموعة من القرد أو الحمض النووي الجينومي البشري أو في مجموعة الحمض النووي الجينومي للفأر.وأخيرا اثنين من السلالات المحددة التمهيدية، واستخدمت لتضخيم الحمض النووي الخنزير في التصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد والخين إلى الفأر، ونماذج زرع الخلايا. أهم شيء يجب تذكره أثناء محاولة هذا البروتوكول هو أنه يجب منع التلوث من جميع الأنواع. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لاستكشاف أسئلة جديدة داخل زراعة xenotransation لأنها طريقة بسيطة منخفضة التكلفة وغير الغازية لرصد الرفض المناعي للxenotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

تحلل الدم ميكروفلويديك الآلي بروتوكول لتخصيب اعارة خلايا الأنوية

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

زرع الأعضاء من الخلايا الجذعية البشرية إلى الأجنة الدجاج

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

كله يشن التحليل المناعى للالجنينية الاطراف الأوعية الدموية الجلدية : نظام نموذجي لدراسة الأوعية الدموية المتفرعة التشكل في الأجنة

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

أخذ عينات الدم من الوريد الذيل الأفقي من الفئران

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...