Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key F&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ201708171721116272), særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og forskrifter i Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University.
1. Design svin specifikke primere
<ol><li>Udfør blastanalyse af hele genomet for at identificere porcinspecifikke gener, der var forskellige fra gener for mennesker, aber eller mus, ved hjælp af softwaren NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).</li>
	<li>Design primere i henhold til 19 svi...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Kvantificering af porcin cirkulerende DNA repræsenterer en mulig tilgang til overvågning af immunafstødning af xenotransplantation. Gadi et al.24 fandt, at donor-afledt cirkulerende DNA (ddcfDNA) indhold i blodet hos patienter med akut afvisning var betydeligt højere end for patienter uden afvisning. Disse undersøgelser tyder på, at ddcfDNA kan være en fælles biomarkør til overvågning af organtransplantationsskader. I de senere år er qPCR i stigende grad blevet anvendt til analyse af nu...

Organsvigt er en af de vigtigste dødsårsager1. Transplantation af celler, væv og organer er en effektiv måde at behandle organsvigt2. Ikke desto mindre begrænser manglen på donororganer den kliniske anvendelse af denne metode3,4. Undersøgelser har vist, at svin kan anvendes som en potentiel kilde til menneskelige organer til klinisk transplantation5,6. Men, cross-arter organtransplantation står over for farlige immun afvisning. Derfor er det afgørende at overvåge immunafstødning af xenotransplantation. I øjeblikket afhænger klinisk monitorering af immunafstødning hovedsageligt af patientens tegn og symptomer samt laboratorieprøver (f.eks. biopsi, immunbiokemisk analyse ogultralyd) 7,8,9. Disse overvågningsmetoder har imidlertid mange ulemper. Tegn og symptomer på immunafstødning hos patienter vises normaltsent 10, hvilket ikke er befordrende for tidlig påvisning og tidlig indgriben; biopsi har den ulempe at væreinvasiv 11, hvilket ikke er let for patienterne at acceptere; immunbiokemisk analyse mangler følsomhed eller specificitet, og ultralyd er ekstra og dyrt. Derfor er det presserende at finde en effektiv og bekvem metode til at overvåge immunafstødning.
Cirkulerende DNA er en ekstracellulær type DNA fundet i blodet. Mandel og Metais12 rapporterede første gang tilstedeværelsen af cirkulerende DNA i perifert blod i 1948. Under normale fysiologiske forhold, cirkulerende DNA i blodet hos raske mennesker er relativt lav ved baseline. Men i nogle patologier, såsom tumorer, myokardieinfarkt, autoimmune sygdomme, og transplantation afvisning, niveauet af cirkulerende DNA i blodet kan øgesbetydeligt 13,14 på grund af den massive frigivelse af cirkulerende DNA forårsaget af apoptose og nekrose. Oprindelsen af cirkulerende DNA er forbundet med apoptose og nekrose15, som er karakteristiske for xenograftafvisning16.
Cirkulerende DNA har vist sig at være en minimalt invasiv biomarkør til påvisning af kræft17,18,19. Høj gennem-put sekvensering af donor-afledte cirkulerende DNA er pålidelig til påvisning af afvisning efter organtransplantation20,21. Men denne metode kræver en høj koncentration og kvalitet af ekstraheret DNA. DNA-kravene ud over de høje omkostninger og tidsforbrug gør denne metode ikke berettiget til rutinemæssig klinisk brug. Donor-afledt cirkulerende DNA kan kvantificeres præcist ved kvantitative real-time PCR (qPCR), som er både specifik og følsom. Derfor er kvantificering af porcin cirkulerende DNA ved qPCR en mulig metode til at overvåge immunafstødning af xenotransplantation. Dette er mindre invasive, meget følsomme og specifikke, lave omkostninger, og tidsbesparende. Svin og mennesker er genetisk adskilte med helt forskellige genomsekvenser (Figur 1). Derfor kan cirkulerende svine-DNA frigives i modtagerens blod efter xenotransplantation på grund af xeno-afvisning. CpsDNA kunne kvantificeres præcist ved qPCR med artsspecifikke primere i recipientens blod. Tidligere har vi vist rationalet og gennemførligheden af cpsDNA som biomarkør for xenotransplantation22,23. Her afslører vi flere eksperimentelle tips og detaljer. Eksperimentet består af følgende trin. For det første blev der designet svinespecifikke primere, og genomisk DNA blev isoleret, som blev brugt til at kontrollere primernes specificitet ved hjælp af almindelig PCR. For det andet, konstruere standard kurven af cpsDNA og isolere cpsDNA fra prøven blod. Endelig blev det cirkulerende svinespecifikke DNA kvantificeret ved hjælp af qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Xenotransplantation er en mulig metode til behandling af organsvigt. Men, hvordan man effektivt kan overvåge immunafvisning af xenotransplantation er et problem for læger og forskere. Dette manuskript beskriver en enkel og effektiv metode til at overvåge immunafstødning i svine-til-mus celle transplantation modeller og svin-til-abe arterie patch transplantation modeller. Cirkulerende DNA er en potentielt ikke-invasiv biomarkør for organskader. I denne undersøgelse blev cirkulerende svinespecifikt DNA (cpsDNA) overvåget under xenograftafvisning ved kvantitativ pcr i realtid (qPCR). I denne protokol blev der designet svinespecifikke primere, der blev fremstillet plasmiderholdige svinespecifikke DNA-fragmenter, og der blev etableret standardkurver for kvantitet. Artsspecifikke primere blev derefter brugt til at kvantificere cpsDNA ved qPCR i svine-til-mus celle transplantation modeller og svin-til-abe arterie patch transplantation modeller. Værdien af denne metode tyder på, at det kan bruges som en enkel, praktisk, lav pris, og mindre invasive metode til at overvåge immunafvisning af xenotransplantation.

I denne protokol blev der konstrueret svinespecifikke primere, plasmiderholdige svinespecifikke DNA-fragmenter blev konstrueret, og der blev etableret standardkurver for kvantitet (figur 4). Arts specificiteter af de 19 primere blev bekræftet af PCR. Artsspecifikke primere (primer #4 og primer #11) blev derefter brugt til at kvantificere cpsDNA ved qPCR i svine-til-mus celle transplantation modeller og svin-til-abe arterie patch transplantation modeller.
Agarose ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

I denne protokol blev der designet svinespecifikke primere, der blev fremstillet plasmiderholdige svinespecifikke DNA-fragmenter, og der blev etableret standardkurver for kvantitet. Ved hjælp af artsspecifikke primere blev cpsDNA kvantificeret af qPCR i svine-til-mus-celletransplantationsmodeller og svin-til-abe-arteriepulptransplantationsmodeller.

Kvantificering af cirkulerende gris-specifikke DNA i blodet af en Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantation er en mulig metode til behandling Af men effektiv overvågning af immunafstødning af xenotransplantation er et problem for læger og forskere. Denne protokol er en enkel, praktisk, lav pris og mindre invasiv metode til at overvåge immunafvisning af xenotransmutation. Denne teknik kan anvendes i xenotransplantation område, herunder gris-til-menneske ø transplantation, nyretransplantation, levertransplantation og hjertetransplantation.Begynd med at overføre 500 mikroliter blodprøver til forskellige mikrocentrifugerør. Der tilsættes 20 mikroliter protease K og 500 mikroliter lysisbuffer i rørene. Derefter grundigt ryste dem til at blande.Sæt rørene i et vandbad ved 56 grader Celsius i 10 minutter, ryste dem to til tre gange under inkubationen, indtil opløsningen bliver klar centrifuge dem kort for at fjerne de flydende perler fra den indre væg af røret dækker. Derefter tilsættes 500 mikroliter af vandfri, ethylalkohol, og ryst grundigt. Overfør blandingen til adsorptionskolonnen.Derefter centrifuges kolonnen i to minutter, og affaldsvæsken kasseres. Tilføj 800 mikroliter skylleopløsning til hver adsorptionssøjle, og centrifuge i et minut. lad kolonnerne blive ved stuetemperatur i et par minutter for at tørre den resterende skylleopløsning.Absorptionssøjlerne overføres til et rent centrifugalrør. Tilføj 50 mikroliter af elution buffer til midten af adsorption film og placere dem ved stuetemperatur i to til fem minutter, derefter centrifuge dem i et minut. Forbered PCR master mix i henhold til manuskript retninger, derefter tilføje 23 mikroliter af blandingen i hver 0,6 milliliter mikrocentrifuge rør.Tilføj to mikroliter af genomisk DNA til hvert rør og omhyggeligt Cabot. Derefter blandes og centrifugeres kortvarigt. Anlæder rørene i en PCR-cykelr, og start forstærkningen.Når reaktionen er færdig udføre Agarose elektroforese. Der tilsættes 1,2 gram Agarose i en kolbe indeholdende 100 millimeter TAE, og den koges i fem minutter i mikrobølgeovnen. Når Agarose er afkølet til ca 70 grader Celsius, tilsæt fem mikroliter af nukleinsyre farvestof i kolben, langsomt, hæld det i pladen og lad det ved stuetemperatur, indtil det størkner i en gel.Tilføj fem mikroliter af hver prøve og 2-Log DNA Ladder eller DNA Marker 1, i brøndene i Agarose gel og elektroforese på 120 millioner pier indtil båndene er adskilt. Visualiser gelen med en ultraviolet imager. Efter at have udført transformation som beskrevet i tekstmanuskriptet, skal plasmiderne kontrolleres ved dobbelt begrænsning af enzymfordøjelsen med EcoR I og Bam HI. Adskaf de fordøjede produkter med 1% Agarose elektroforese og udsætte gelen til UV-lys.Den koncentrerede plasmid fortyndes med fragmentet af porcin-DNA til to gange 10 til 11. For at etablere en standardkurve skal du forberede en qPCR-masterblanding, som beskrevet i tekstmanuskriptet, og der tilsættes 40 mikroliter af blandingen i hvert rør på en otte-rørstrimmel. Tilsæt 10 mikroliter af standard DNA af forskellige koncentrationer, cap rørene derefter kort blandes og centrifuge dem.Anfør rørene i qPCR-maskinen, og udfør forstærkningen. Brug EDTA-rør til at indsamle blodprøver fra ca. 400 mikroliter fra svine-til-abe-arteriespatchmodellerne eller 100 mikroliter fra svine-til-musecelletransplantationsmodellerne. Derefter overføres prøverne til 1,5 milliliter centrifugerør.Fjern blodcellerne fra blodprøverne ved centrifugering ved lav temperatur og høj hastighed. Supernatanten overføres til et nyt centrifugerør på 1,5 milliliter, og celleaffaldet fjernes ved centrifugering ved 16.000 gange G i 10 minutter. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 millilitercentrifugerør, og ekstrakt det cirkulerende DNA ved hjælp af et kommercielt serum, mens det cirkulerer DNA-ekstraktionssæt.Kondenser mængden af cirkulerende DNA til 40 mikroliter og gemme det på negative 20 grader Celsius. Udfør qPCR for at kvantificere det cirkulerende svinespecifikke DNA. Porcine-specifikke primere blev designet og brugt til at kvantificere cirkulerende gris-specifikke DNA ved qPCR, i svin-til-mus celle transplantation modeller og svin-til-abe arterie patch, transplantation modeller.Agarose elektroforese blev brugt til at isolere forstærkede DNA-fragmenter. Ved hjælp af PCR blev de primere-specifikke for forstærket porcine genomisk DNA identificeret. Dernæst blev artsspecifikke forhold af disse primere i kohorten af abe eller humant genomisk DNA eller i kohorten af musegenomisk DNA bekræftet.Endelig blev to artsspecifikke primere brugt til at forstærke svine-DNA i svine-til-abe-arterieprettelsen og svin til mus, celletransplantationsmodeller. Det vigtigste at huske, mens du forsøger denne protokol, er, at forurening af alle slags bør forhindres. Denne teknik baner vejen for forskere til at udforske nye spørgsmål inden xenotransplantation, fordi det er en simpel billig og ikke invasiv metode til at overvåge immunafvisning af xenotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisering af DNA-replikation i hvirveldyr modelsystem DT40 ved hjælp af DNA-Fiber Teknik

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging af Single Engineered RNA-transkripter i levende celler Brug Ratiometrisk bimolekylær Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blodprøvetagning fra den laterale halevene af Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genom-dækkende Kortlægning af lægemiddel-DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tværbinding af små molekyler til at isolere Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...