Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangd provincie (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds voor high level medical discipline bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van de Institutional Review Board van Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital van de Universiteit van Shenzhen.
1. Ontwerp varkensspecifieke primers
<ol><li>Uitvoeren van het hele genoom BLAST analyse om varkens specifieke genen die anders waren dan die van mensen, apen of muis te identificeren, met behulp van de software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).</li>
	<li>Ontwerp pri...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Het kwantificeren van varkens dat circulerend DNA circuleert, is een haalbare aanpak om de immuunafstoting van xenotransplantatie te monitoren. Gadi et al.24 vonden dat het circulatie-DNA(ddcfDNA) van donoren in het bloed van patiënten met acute afstoting aanzienlijk hoger was dan dat van patiënten zonder afstoting. Deze studies suggereren dat ddcfDNA kan een gemeenschappelijke biomarker voor het toezicht op orgaantransplantatie schade. In de afgelopen jaren is qPCR steeds meer toegepast op de a...

Orgaanfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken1. Transplantatie van cellen, weefsels en organen is een effectieve manier om orgaanfalen te behandelen2. Niettemin beperkt het tekort aan donororganen de klinische toepassing van deze methode3,4. Studies hebben aangetoond dat varkens kunnen worden gebruikt als een potentiële bron van menselijke organen voor klinische transplantatie5,6. Echter, kruissoorten orgaantransplantatie gezichten gevaarlijke immuunafstoting. Daarom is het cruciaal om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren. Momenteel is de klinische monitoring van immuunafstoting voornamelijk afhankelijk van de tekenen en symptomen van de patiënt, evenals laboratoriumtests (bijvoorbeeld biopsie, immunobiochemische analyse en echografie)7,8,9. Deze bewakingsmethoden hebben echter veel nadelen. De tekenen en symptomen van immuunafstoting bij patiënten verschijnen meestal laat10, wat niet bevorderlijk is voor vroegtijdige opsporing en vroegtijdige interventie; biopsie heeft het nadeel invasieve11, wat niet gemakkelijk is voor patiënten te accepteren; immunobiochemische analyse mist gevoeligheid of specificiteit, en echografie is hulp en duur. Daarom is het dringend noodzakelijk om een effectieve en handige methode te vinden om de immuunafstoting te controleren.
Circulerend DNA is een extracellulair type DNA gevonden in bloed. Mandel en Metais12 meldden voor het eerst de aanwezigheid van circulerend DNA in perifeer bloed in 1948. Onder normale fysiologische omstandigheden is circulerend DNA in het bloed van gezonde mensen relatief laag bij aanvang. Echter, in sommige pathologieën, zoals tumoren, hartinfarct, auto-immuunziekten, en transplantatie afwijzing, het niveau van circulerende DNA in het bloed kan aanzienlijk worden verhoogd13,14 als gevolg van de massale afgifte van circulerend DNA veroorzaakt door apoptose en necrose. De oorsprong van circulerend DNA wordt geassocieerd met apoptose en necrose15, die kenmerkend zijn voor xenograftafstotie16.
Circulerend DNA is bewezen een minimaal invasieve biomarker te zijn voor het opsporen van kanker17,18,19. Hoge door-put sequencing van donor-afgeleid circulerend DNA is betrouwbaar voor de opsporing van afstoting na orgaantransplantatie20,21. Deze methode vereist echter een hoge concentratie en kwaliteit van geëxtraheerd DNA. De DNA-eisen in aanvulling op de hoge kosten en tijd-consumptie maken deze methode niet in aanmerking voor routinematig klinisch gebruik. Donor-afgeleid circulerend DNA kan nauwkeurig worden gekwantificeerd door kwantitatieve real-time PCR (qPCR), die zowel specifiek als gevoelig is. Daarom is het kwantificeren van varkens die DNA doorgeven door qPCR een haalbare methode om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren. Dit is minder invasief, zeer gevoelig en specifiek, lage kosten en tijdbesparend. Varkens en mensen zijn genetisch gescheiden met heel verschillende genomische sequenties(figuur 1). Daarom kan circulerend varkens-DNA worden vrijgegeven in het bloed van de ontvanger na de xenotransplantatie als gevolg van xeno-afwijzing. CpsDNA kan nauwkeurig worden gekwantificeerd door qPCR met soortspecifieke primers in het bloed van de ontvanger. Eerder hebben we de beweegredenen en haalbaarheid van cpsDNA als biomarker voor xenotransplantatie22,23aangetoond . Hier onthullen we meer experimentele tips en details. Het experiment bestaat uit de volgende stappen. Ten eerste werden varkensspecifieke primers ontworpen en werd genomisch DNA geïsoleerd, die werden gebruikt om de specificiteit van de primers te verifiëren door reguliere PCR. Ten tweede, de bouw van de standaardcurve van cpsDNA en het isoleren van cpsDNA uit het monsterbloed. Ten slotte werd het circulerende varkensspecifieke DNA gekwantificeerd met behulp van qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Xenotransplantatie is een haalbare methode om orgaanfalen te behandelen. Echter, hoe effectief te controleren van de immuunafstoting van xenotransplantatie is een probleem voor artsen en onderzoekers. Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en effectieve methode om immuunafstoting te controleren in celtransplantatiemodellen van varkens tot muis en patchtransplantatiemodellen van varkens tot aap. Circulerend DNA is een potentieel niet-invasieve biomarker voor orgaanschade. In deze studie werd circulerend varkensspecifiek DNA (cpsDNA) gemonitord tijdens xenograft afwijzing door kwantitatieve real-time PCR (qPCR). In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Soortenspecifieke primers werden vervolgens gebruikt om cpsDNA te kwantificeren door qPCR in varkens-tot-muis celtransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagaderpatch transplantatiemodellen. De waarde van deze methode suggereert dat het kan worden gebruikt als een eenvoudige, handige, lage kosten, en minder invasieve methode om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren.

In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld (figuur 4). De specifieke kenmerken van de soorten van de 19 primers werden bevestigd door PCR. Soortenspecifieke primers (primer #4 en primer #11) werden vervolgens gebruikt om cpsDNA te kwantificeren door qPCR in varkens-tot-muis celtransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagader patch transplantatie ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Met behulp van soortspecifieke primers werd cpsDNA door qPCR gekwantificeerd in varkens-tot-muisceltransplantatiemodellen en varkens-tot-aap slagaderpatch transplantatiemodellen.

Kwantificering van circulerend varkensspecifiek DNA in het bloed van een Xenotransplantatie Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantatie is een haalbare methode om te behandelen Echter, effectieve monitoring van de immuunafstoting van xenotransplantatie is een probleem voor artsen en de onderzoekers. Dit protocol is een eenvoudige, handige, lage kosten en minder invasieve methode om de immuunafstoting van de xenotransmutatie te controleren. Deze techniek kan worden gebruikt in xenotransplantatie veld, met inbegrip van pig-to-human eilandje transplantatie, niertransplantatie, levertransplantatie en harttransplantatie.Begin met het overbrengen van 500 microliter bloedmonsters in verschillende microcentrifugebuizen. Voeg 20 microliter protease K en 500 microliter lysisbuffer toe aan de buizen. Dan grondig schudden ze te mengen.Zet de buizen in een waterbad op 56 graden Celsius gedurende 10 minuten, schudden ze twee tot drie keer tijdens de incubatie totdat de oplossing duidelijk wordt centrifuge ze kort om de vloeibare kralen te verwijderen uit de binnenwand van de buis covers. Voeg vervolgens 500 microliter watervrije, ethylalcohol toe en schud grondig. Breng het mengsel over naar de adsorptiekolom.Centrifuge de kolom vervolgens gedurende twee minuten en gooi de restvloeistof weg. Voeg 800 microliter spoeloplossing toe aan elke adsorptiekolom en centrifuge gedurende één minuut. laat de kolommen op kamertemperatuur gedurende enkele minuten om de resterende spoeloplossing te drogen.Breng de absorptiekolommen over naar een schone centrifugaalbuis. Voeg 50 microliters elutiebuffer toe aan het midden van de adsorptiefilms en plaats ze twee tot vijf minuten op kamertemperatuur en vercenter ze gedurende één minuut. Bereid de PCR master mix volgens manuscript aanwijzingen, voeg dan 23 microliter van de mix in elke 0,6 milliliter micro centrifuge buis.Voeg twee microliter genomisch DNA toe aan elke buis en zorgvuldig Cabot. Meng en vercentrifuge vervolgens kort. Plaats de buizen in een PCR cycler en start de versterking.Wanneer de reactie klaar is uit te voeren Agarose elektroforese. Voeg 1,2 gram Agarose toe in een kolf met honderd millimeter TAE en kook het vijf minuten in de magnetron. Zodra de Agarose is afgekoeld tot ongeveer 70 graden Celsius, voeg vijf microliters van nucleïnezuur kleurstof in de kolf, langzaam, giet het in de plaat en laat het op kamertemperatuur totdat het stolt in een gel.Voeg vijf microliter van elk monster en 2-Log DNA Ladder of DNA Marker 1, in de putten van de Agarose gel en elektroforese op 120 miljoen pier totdat de banden zijn gescheiden. Visualiseer de gel met een ultraviolette imager. Na het uitvoeren van transformatie zoals beschreven in de tekst manuscript, controleer de plasmiden door dubbele beperking enzym spijsvertering met EcoR I en Bam HI. Scheid de verteerde producten met 1%Agarose elektroforese en stel de gel bloot aan UV-licht.Verdun de geconcentreerde plasmid met het fragment van varkens-DNA tot twee keer 10 tot de 11e exemplaren per milliliter voor de startstandaardoplossing, Met behulp van dubbel gedestilleerd water. Om een standaardcurve vast te stellen, bereidt u een qPCR-mastermix voor, zoals beschreven in het tekstmanuscript en voegt u 40 microliter van de mix toe aan elke buis van een strook met acht buizen. Voeg 10 microliter standaard DNA van verschillende concentraties toe, dop de buizen vervolgens kort en centrifuge ze.Plaats de buizen in de qPCR-machine en voer de versterking uit. Gebruik EDTA buizen om bloedmonsters van ongeveer 400 microliters te verzamelen van de pig-to-monkey slagader patch modellen, of 100 microliters van de pig-to-mouse celtransplantatie modellen. Breng de monsters vervolgens over op 1,5 milliliter centrifugebuizen.Verwijder de bloedcellen uit de bloedmonsters door centrifugatie bij lage temperatuur en hoge snelheid. Breng de supernatant over op een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter en verwijder het celpuin door middel van centrifugatie op 16.000 keer G gedurende 10 minuten. Breng de supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter centrifugebuis en haal het circulerende DNA eruit met behulp van een commercieel serum tijdens de circulatie van DNA-extractiekit.Condenseer het volume circulerend DNA tot 40 microliter en bewaar het bij negatieve 20 graden Celsius. Voer qPCR uit om het circulerende varkensspecifieke DNA te kwantificeren. Varkensspecifieke primers werden ontworpen en gebruikt om circulerend varkensspecifiek DNA te kwantificeren door qPCR, in varkens-tot-muisceltransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagaderpatch, transplantatiemodellen.Agarose elektroforese werd gebruikt om versterkte DNA-fragmenten te isoleren. Met behulp van PCR werden de primers-specifiek voor versterkt varkens genomic DNA geïdentificeerd. Vervolgens werden soortenspecificiteiten van deze primers in het cohort van aap of menselijk genomisch DNA of in het cohort van muisgenomic DNA bevestigd.Tot slot werden twee soorten-specifieke primers, gebruikt om varkens-DNA te versterken in de varkens-tot-aap slagader patch en varken aan muis, celtransplantatie modellen. Het belangrijkste om te onthouden tijdens een poging dit protocol, is dat besmetting van alle soorten moet worden voorkomen. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om nieuwe vragen binnen xenotransplantatie te verkennen, omdat het een eenvoudige goedkope en niet-invasieve methode is om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplantatie van menselijke stamcellen in het kippenembryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Bloedafname van de Lateral staartader van de Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...