Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par des subventions du National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), de la Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), des fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau à Guangd province de Sanming (2019), Projet sanming de médecine à Shenzhen (SZSM201412020), Fonds pour la construction de discipline médicale de haut niveau de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et règlements pertinents du Conseil d’examen institutionnel du Shenzhen Second People’s Hospital, first affiliated hospital of Shenzhen University.
1. Concevoir des amorces spécifiques de porcin
<ol><li>Effectuez l’analyse blast du génome entier pour identifier des gènes spécifiques aux porcins qui étaient différents de ceux des humains, des singes ou des souris, à l’aide du logiciel NCBI (www.ncbi.nlm...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Quantifier l’ADN circulant porcin représente une approche réalisable pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. Gadi et coll.24 ont constaté que la teneur en ADN circulant (DdcfDNA) dérivée du donneur dans le sang des patients présentant un rejet aigu était significativement plus élevée que celle des patients sans rejet. Ces études suggèrent que le ddcfDNA puisse être un biomarqueur commun pour surveiller des dommages de greffe d’organe. Ces dernières années...

La défaillance des organes est l’une des principales causes dedécès 1. La transplantation de cellules, de tissus et d’organes est un moyen efficace de traiter l’insuffisance organique2. Néanmoins, la pénurie d’organes donneurs limite l’application clinique de cetteméthode 3,4. Des études ont montré que les porcs peuvent être utilisés comme source potentielle d’organes humains pour la transplantationclinique 5,6. Cependant, la transplantation d’organes inter-espèces fait face à un rejet immunitaire dangereux. Par conséquent, il est crucial de surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. À l’heure actuelle, la surveillance clinique du rejet immunitaire dépend principalement des signes et symptômes du patient, ainsi que des tests de laboratoire (p. ex., biopsie, analyse immunobiochimique et échographie)7,8,9. Toutefois, ces méthodes de surveillance ont de nombreux inconvénients. Les signes et les symptômes du rejet immunitaire chez les patients apparaissent habituellement à la finde 10, ce qui n’est pas propice à la détection précoce et l’intervention précoce; biopsie a l’inconvénient d’être invasive11, ce qui n’est pas facile pour les patients à accepter; l’analyse immunobiochimique manque de sensibilité ou de spécificité, et l’échographie est auxiliaire et coûteuse. Par conséquent, il est urgent de trouver une méthode efficace et pratique pour surveiller le rejet immunitaire.
L’ADN circulant est un type extracellulaire d’ADN trouvé dans le sang. Mandel et Metais12 ont signalé pour la première fois la présence d’ADN circulant dans le sang périphérique en 1948. Dans des conditions physiologiques normales, l’ADN circulant dans le sang des personnes en bonne santé est relativement faible à la ligne de base. Cependant, dans quelques pathologies, telles que des tumeurs, l’infarctus du myocarde, les maladies auto-immunes, et le rejet de greffe, le niveau de l’ADN circulant dans le sang peutêtre sensiblement augmenté 13,14 dû à la libération massive de l’ADN circulant provoqué par l’apoptose et la nécrose. L’origine de l’ADN circulant est associée à l’apoptose et à la nécrose15,qui sont caractéristiques du rejet de xénogreffe16.
Il a été prouvé que l’ADN circulant est un biomarqueur mini-invasif pour détecter les cancers17,18,19. Le séquençage par voie élevée de l’ADN circulant dérivé du donneur est fiable pour la détection du rejet après transplantationd’organe 20,21. Cependant, cette méthode exige une concentration élevée et la qualité de l’ADN extrait. Les exigences en matière d’ADN, en plus du coût élevé et de la consommation de temps, rendent cette méthode inadmissible à une utilisation clinique de routine. L’ADN circulant dérivé du donneur peut être quantifié avec précision par pcr quantitatif en temps réel (QPCR), qui est à la fois spécifique et sensible. Par conséquent, la quantification de l’ADN circulant porcin par qPCR est une méthode faisable pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. Il s’agit d’un gain de temps moins invasif, hautement sensible et spécifique, peu coûteux et moins coûteux. Les porcs et les êtres humains sont génétiquement séparés avec des séquences génomiques très différentes (Figure 1). Par conséquent, l’ADN porcin circulant peut être libéré dans le sang du destinataire post-xénotransplantation en raison du xéno-rejet. CpsDNA pourrait être précisément quantifié par qPCR avec des amorces spécifiques aux espèces dans le sang du receveur. Auparavant, nous avons démontré la justification et la faisabilité de cpsDNA en tant que biomarqueur pour la xénotransplantation22,23. Ici, nous divulguons plus de conseils expérimentaux et de détails. L’expérience se compose des étapes suivantes. Tout d’abord, des amorces spécifiques de porcine ont été conçues, et l’ADN génomique a été isolé, qui ont été utilisés pour vérifier la spécificité des amorce par PCR régulier. Deuxièmement, la construction de la courbe standard de cpsDNA et l’isolement de cpsDNA à partir du sang échantillonné. Enfin, l’ADN spécifique au porc en circulation a été quantifié à l’aide de qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

La xénotransplantation est une méthode réalisable pour traiter l’insuffisance des organes. Cependant, comment surveiller efficacement le rejet immunitaire de la xénotransplantation est un problème pour les médecins et les chercheurs. Ce manuscrit décrit une méthode simple et efficace pour surveiller le rejet immunitaire dans les modèles de transplantation de cellules de porc à souris et les modèles de transplantation de patch d’artère de porc à singe. L’ADN circulant est un biomarqueur potentiellement non invasif pour les dommages aux organes. Dans cette étude, l’ADN pigo-spécifique circulant (cpsDNA) a été surveillé pendant le rejet de xénogreffe par PCR quantitatif en temps réel (qPCR). Dans ce protocole, des amorces spécifiques de porcin ont été conçues, des fragments spécifiques d’ADN de porcine contenant des plasmides ont été construits, et des courbes standard pour la quantitation ont été établies. Des amorces spécifiques aux espèces ont ensuite été utilisées pour quantifier la cpsDNA par qPCR dans des modèles de transplantation cellulaire de porc à souris et des modèles de transplantation de patchs d’artère de porc à singe. La valeur de cette méthode suggère qu’elle peut être utilisée comme méthode simple, pratique, peu coûteux et moins invasive pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation.

Dans ce protocole, des amorces spécifiques aux porcins ont été conçues, des fragments d’ADN spécifiques aux porcins contenant des plasmides ont été construits et des courbes standard de quantitation ont été établies (figure 4). Les spécificités des espèces des 19 amorces ont été confirmées par PCR. Des amorces spécifiques aux espèces (#4 d’amorce et #11 d’amorce) ont ensuite été utilisées pour quantifier la cpsDNA par qPCR dans des modèles de transplantation cellu...

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Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Dans ce protocole, des amorces spécifiques de porcin ont été conçues, des fragments spécifiques d’ADN de porcine contenant des plasmides ont été construits, et des courbes standard pour la quantitation ont été établies. À l’aide d’amorces spécifiques aux espèces, cpsDNA a été quantifié par qPCR dans des modèles de transplantation de cellules de porc à souris et des modèles de transplantation de patchs d’artère de porc à singe.

Quantification de l’ADN spécifique du porc circulant dans le sang d’un modèle de xénotransplantation

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantation est une méthode réalisable pour traiter Cependant, une surveillance efficace du rejet immunitaire de la xénotransplantation est un problème pour les médecins et les chercheurs. Ce protocole est une méthode simple, pratique, peu coûteux et moins invasive pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransmutation. Cette technique peut être utilisée dans le domaine de la xénotransplantation, y compris la transplantation d’îlots de porc à l’homme, la transplantation rénale, la transplantation hépatique et la transplantation cardiaque.Commencez par transférer 500 microlitres d’échantillons de sang dans différents tubes de micro centrifugeuse. Ajouter 20 microlitres de protéase K et 500 microlitres de tampon de lyse dans les tubes. Ensuite, secouez-les soigneusement pour mélanger.Mettez les tubes dans un bain d’eau à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes, en les secouant deux à trois fois pendant l’incubation jusqu’à ce que la solution devienne une centrifugeuse claire brièvement pour enlever les perles liquides de la paroi intérieure des couvercles du tube. Ajouter ensuite 500 microlitres d’alcool anhydre et éthylique et bien agiter. Transférer le mélange dans la colonne d’adsorption.Ensuite, centrifugez la colonne pendant deux minutes et jetez le liquide de rebut. Ajoutez 800 microlitres de solution de rinçage à chaque colonne d’adsorption et centrifugeuse pendant une minute. laisser les colonnes à température ambiante pendant quelques minutes pour sécher le reste de la solution de rinçage.Transférer les colonnes d’absorption dans un tube centrifuge propre. Ajouter 50 microlitres de tampon d’élitution au milieu des films d’adsorption et les placer à température ambiante pendant deux à cinq minutes, puis les centrifuger pendant une minute. Préparer le mélange principal PCR selon les instructions manuscrites, puis ajouter 23 microlitres du mélange dans chaque tube de centrifugeuse micro de 0,6 millilitre.Ajouter deux microlitres d’ADN génomique à chaque tube et soigneusement Cabot. Mélanger et centrifugeuse brièvement. Placez les tubes dans un cycleur PCR et démarrez l’amplification.Lorsque la réaction est terminée effectuer électrophoresis Agarose. Ajouter 1,2 gramme d’Agarose dans un flacon contenant cent millimètres de TAE et le faire bouillir pendant cinq minutes au micro-ondes. Une fois que l’Agarose a refroidi à environ 70 degrés Celsius, ajouter cinq microlitres de colorant acide nucléique dans le flacon, lentement, le verser dans la plaque et le laisser à température ambiante jusqu’à ce qu’il se solidifie en gel.Ajouter cinq microlitres de chaque échantillon et 2-Log ÉCHELLE d’ADN ou marqueur d’ADN 1, dans les puits du gel Agarose et l’électrophoresis à 120 millions de pilier jusqu’à ce que les bandes sont séparées. Visualisez le gel à l’aide d’un imageur ultraviolet. Après avoir effectué la transformation telle que décrite dans le manuscrit de texte, vérifiez les plasmides par digestion d’enzyme de double restriction avec EcoR I et Bam HI. Séparez les produits digérés avec 1% d’électrophorèse agarose et exposez le gel à la lumière UV.Diluer le plasmide concentré avec le fragment d’ADN porcin à deux fois 10 à 11e copies par millilitre pour la solution standard de départ, en utilisant de l’eau distillée double. Pour établir une courbe standard, préparez un mélange de maîtres qPCR, tel que décrit dans le manuscrit du texte et ajoutez 40 microlitres du mélange dans chaque tube d’une bande de huit tubes. Ajouter 10 microlitres d’ADN standard de différentes concentrations, plafonner les tubes puis les mélanger brièvement et les centrifuger.Placez les tubes dans la machine qPCR et effectuez l’amplification. Utilisez des tubes EDTA pour recueillir des échantillons de sang d’environ 400 microlitres des modèles de patch d’artère de porc à singe, ou 100 microlitres des modèles de transplantation de cellules de porc à souris. Transférer ensuite les échantillons dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre.Retirer les cellules sanguines des échantillons de sang par centrifugation à basse température et à grande vitesse. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitres et enlever les débris cellulaires par centrifugation à 16 000 fois G pendant 10 minutes. Transférer le supernatant dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 millilitre et extraire l’ADN circulant à l’aide d’un sérum commercial tout en faisant circuler le kit d’extraction d’ADN.Condensez le volume d’ADN circulant à 40 microlitres et stockez-le à 20 degrés Celsius négatifs. Effectuer qPCR pour quantifier l’ADN circulant spécifique au porc. Les amorces spécifiques aux porcins ont été conçues et utilisées pour quantifier l’ADN circulant spécifique aux porcs par qPCR, dans des modèles de transplantation de cellules de porc à souris et de patch d’artère de porc à singe, modèles de transplantation.L’électrophoresis d’Agarose a été employé pour isoler des fragments amplifiés d’ADN. À l’aide de PCR, les amorces spécifiques à l’ADN génomique porcin amplifié ont été identifiées. Ensuite, les spécificités des espèces de ces amorce dans la cohorte de l’ADN génomique du singe ou de l’homme ou dans la cohorte de l’ADN génomique de souris, ont été confirmées.Enfin, deux amorces spécifiques à chaque espèce, ont été utilisées pour amplifier l’ADN de porc dans le patch de l’artère porc-singe et de porc à souris, modèles de transplantation cellulaire. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole, c’est que la contamination de toutes sortes devrait être évitée. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer de nouvelles questions au sein de la xénotransplantation parce qu’il s’agit d’une méthode simple à faible coût et non invasive pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Automated Protocole microfluidiques lyse du sang pour l&#39;enrichissement de cellules circulantes nucléées

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Recherche

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

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DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

La xénotransplantation de cellules souches humaines dans l&#39;embryon de poulet

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

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Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

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Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

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The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

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Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...