Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong unterstützt. Provinz (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des Institutional Review Board des Shenzhen Second People es Hospital, First Affiliated Hospital der Shenzhen University durchgeführt.
1. Entwerfen Sie porcine spezifische Primer
<ol><li>Führen Sie eine Vollgenom-BLAST-Analyse durch, um porenspezifische Gene zu identifizieren, die sich von denen von Menschen, Affen oder Mäusen unterschieden, mit der Software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).</li>
	<...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. 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K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Die Quantifizierung der zirkulierenden Poren-DNA stellt einen praktikablen Ansatz zur Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantationen dar. Gadi et al.24 fanden heraus, dass der von Spendern abgeleitete zirkulierende DNA-Gehalt (ddcfDNA) im Blut von Patienten mit akuter Abstoßung signifikant höher war als der von Patienten ohne Abstoßung. Diese Studien deuten darauf hin, dass ddcfDNA ein häufiger Biomarker für die Überwachung von Organtransplantatschäden sein kann. In den letzten ...

Organversagen ist eine der Haupttodesursachen1. Transplantation von Zellen, Geweben und Organen ist ein effektiver Weg, um Organversagen zu behandeln2. Dennoch schränkt der Mangel an Spenderorganen die klinische Anwendung dieser Methodeein 3,4. Studien haben gezeigt, dass Schweine als potenzielle Quelle menschlicher Organe für die klinische Transplantation verwendet werden können5,6. Die artenübergreifende Organtransplantation ist jedoch mit einer gefährlichen Immunabstoßung konfrontiert. Daher ist es wichtig, die Immunabstoßung von Xenotransplantation zu überwachen. Derzeit hängt die klinische Überwachung der Immunabstoßung hauptsächlich von den Anzeichen und Symptomen des Patienten ab, sowie von Labortests (z.B. Biopsie, immunbiochemische Analyse und Ultraschall)7,8,9. Diese Überwachungsmethoden haben jedoch viele Nachteile. Die Anzeichen und Symptome einer Immunabstoßung bei Patienten erscheinen in der Regel spät10, was nicht förderlich für Früherkennung und frühzeitige Intervention ist; Biopsie hat den Nachteil, invasiv zu sein11, was für Patienten nicht leicht zu akzeptieren ist; Immunbiochemische Analyse fehlt Empfindlichkeit oder Spezifität, und Ultraschall ist Hilfs- und teuer. Daher ist es dringend notwendig, eine effektive und bequeme Methode zu finden, um die Immunabstoßung zu überwachen.
Zirkulierende DNA ist eine extrazelluläre Art von DNA, die im Blut gefunden wird. Mandel und Metais12 berichteten erstmals 1948 über das Vorhandensein von zirkulierender DNA im peripheren Blut. Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die zirkulierende DNA im Blut gesunder Menschen zu Beginn relativ niedrig. Jedoch, in einigen Pathologien, wie Tumoren, Myokardinfarkt, Autoimmunerkrankungen, und Transplantation Abstoßung, kann der Grad der zirkulierenden DNA im Blut deutlich erhöht werden13,14 aufgrund der massiven Freisetzung von zirkulierender DNA durch Apoptose und Nekrose verursacht. Der Ursprung der zirkulierenden DNA ist mit Apoptose und Nekrose15verbunden, die für die Xenograft-Abstoßung16charakteristisch sind.
Zirkulierende DNA hat sich als minimal-invasiver Biomarker zum Nachweis von Krebserkrankungen17,18,19erwiesen. Eine hohe Durchsatzsequenzierung der von Spendern abgeleiteten zirkulierenden DNA ist zuverlässig für den Nachweis der Abstoßung nach Organtransplantation20,21. Diese Methode erfordert jedoch eine hohe Konzentration und Qualität der extrahierten DNA. Die DNA-Anforderungen zusätzlich zu den hohen Kosten und dem hohen Zeitverbrauch machen diese Methode für eine routinemäßige klinische Anwendung nicht förderfähig. Spender-abgeleitete zirkulierende DNA kann durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) genau quantifiziert werden, die sowohl spezifisch als auch empfindlich ist. Daher ist die Quantifizierung der zirkulierenden Porcine-DNA durch qPCR eine praktikable Methode, um die Immunabstoßung von Xenotransplantationen zu überwachen. Dies ist weniger invasiv, hochsensibel und spezifisch, kostengünstig und zeitsparend. Schweine und Menschen sind genetisch getrennt mit ganz unterschiedlichen genomischen Sequenzen (Abbildung 1). Daher kann zirkulierende Schweine-DNA aufgrund von Xeno-Abstoßung in das Blut des Empfängers freigesetzt werden. CpsDNA könnte durch qPCR mit artspezifischen Primern im Blut des Empfängers präzise quantifiziert werden. Zuvor haben wir die Gründe und Machbarkeit von cpsDNA als Biomarker für xenotransplantation22,23demonstriert. Hier geben wir weitere experimentelle Tipps und Details bekannt. Das Experiment besteht aus den folgenden Schritten. Erstens wurden porenspezifische Primer entwickelt und genomische DNA isoliert, die verwendet wurde, um die Spezifität der Primer durch regelmäßige PCR zu überprüfen. Zweitens, die Konstruktion der Standardkurve von cpsDNA und die Isolierung von cpsDNA aus dem Probenblut. Schließlich wurde die zirkulierende schweinespezifische DNA mit qPCR quantifiziert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Xenotransplantation ist eine praktikable Methode zur Behandlung von Organversagen. Jedoch, wie die Immunabstoßung von Xenotransplantation effektiv zu überwachen ist ein Problem für Ärzte und Forscher. Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und effektive Methode zur Überwachung der Immunabstoßung in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen. Zirkulierende DNA ist ein potenziell nicht-invasiver Biomarker für Organschäden. In dieser Studie wurde zirkulierende schweinespezifische DNA (cpsDNA) während der Xenograft-Abstoßung durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) überwacht. In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Artspezifische Primer wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren. Der Wert dieser Methode legt nahe, dass es als eine einfache, bequeme, kostengünstige und weniger invasive Methode verwendet werden kann, um die Immunabstoßung von Xenotransplantation zu überwachen.

In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt (Abbildung 4). Die Spezifitäten der 19 Primer wurden von PCR bestätigt. Artspezifische Primer (Primer #4 und Primer #11) wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren.
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Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Anhand artspezifischer Primer wurde cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen quantifiziert.

Quantifizierung der zirkulierenden schweinespezifischen DNA im Blut eines Xenotransplantationsmodells

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantation ist eine praktikable Methode zur Behandlung Jedoch, effektive Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantation ist ein Problem für Ärzte und die Forscher. Dieses Protokoll ist eine einfache, bequeme, kostengünstige und weniger invasive Methode, um die Immunabstoßung der Xenotransmutation zu überwachen. Diese Technik kann im Xenotransplantationsfeld eingesetzt werden, einschließlich Schweine-zu-Mensch-Islet-Transplantation, Nierentransplantation, Lebertransplantation und Herztransplantation.Beginnen Sie mit der Übertragung von 500 Mikroliter blutproben in verschiedene Mikrozentrifugenröhren. 20 Mikroliter Protease K und 500 Mikroliter Lysepuffer in die Schläuche geben. Dann gründlich schütteln sie zu mischen.Legen Sie die Rohre in ein Wasserbad bei 56 Grad Celsius für 10 Minuten, schütteln Sie sie zwei bis drei Mal während der Inkubation, bis die Lösung klar Zentrifuge sie kurz zentrifuge, um die flüssigen Perlen von der Innenwand der Rohrabdeckungen zu entfernen. Dann 500 Mikroliter Wasserkraft, Ethylalkohol hinzufügen und gründlich schütteln. Übertragen Sie die Mischung in die Adsorptionsspalte.Dann zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten und entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit. Fügen Sie 800 Mikroliter Spüllösung zu jeder Adsorptionssäule und Zentrifuge für eine Minute hinzu. Lassen Sie die Säulen für einige Minuten bei Raumtemperatur, um die verbleibende Spüllösung zu trocknen.Übertragen Sie die Absorptionssäulen in ein sauberes Zentrifugalrohr. Fügen Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer in die Mitte der Adsorptionsfolien und legen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten, dann Zentrifugieren Sie sie für eine Minute. Bereiten Sie den PCR-Master-Mix nach Manuskriptanweisungen vor, und fügen Sie dann 23 Mikroliter der Mischung in jedes 0,6 Milliliter Mikrozentrifugenrohr ein.Fügen Sie zwei Mikroliter genomischer DNA zu jeder Röhre und sorgfältig Cabot. Dann kurz mischen und Zentrifugen. Legen Sie die Rohre in einen PCR-Cycler und starten Sie die Verstärkung.Wenn die Reaktion beendet ist, führen Sie Agarose Elektrophorese. 1,2 Gramm Agarose in einen Kolben mit hundert Millimetertae geben und fünf Minuten in der Mikrowelle kochen. Sobald die Agarose auf ca. 70 Grad Celsius abgekühlt ist, fügen Sie fünf Mikroliter Nukleinsäurefarbstoff in den Kolben, langsam, gießen Sie es in die Platte und lassen Sie es bei Raumtemperatur, bis es zu einem Gel verfestigt.Fügen Sie fünf Mikroliter jeder Probe und 2-Log DNA Leiter oder DNA Marker 1, in die Brunnen des Agarose Gel und Elektrophorese bei 120 Millionen Pier, bis die Bänder getrennt sind. Visualisieren Sie das Gel mit einem ultravioletten Imager. Nach der Transformation, wie im Textmanuskript beschrieben, überprüfen Sie die Plasmide durch doppelte Restriktionsenzymverdauung mit EcoR I und Bam HI. Trennen Sie die verdauten Produkte mit 1%Agarose-Elektrophorese und setzen Sie das Gel UV-Licht aus.Verdünnen Sie das konzentrierte Plasmid mit dem Fragment der Schweine-DNA auf zwei mal 10 bis die 11. Kopien pro Milliliter für die Ausgangsstandardlösung, mit doppelt destilliertem Wasser. Um eine Standardkurve zu erstellen, bereiten Sie einen qPCR-Mastermix vor, wie im Textmanuskript beschrieben, und fügen Sie 40 Mikroliter der Mischung in jedes Rohr eines Achtrohrstreifens ein. Fügen Sie 10 Mikroliter Standard-DNA in verschiedenen Konzentrationen hinzu, kappen Sie die Röhren dann kurz und zentrifugieren Sie sie.Legen Sie die Rohre in die qPCR-Maschine und führen Sie die Verstärkung durch. Verwenden Sie EDTA-Röhren, um Blutproben von etwa 400 Mikrolitern aus den Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Modellen oder 100 Mikroliter aus den Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen zu sammeln. Dann die Proben in 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen.Entfernen Sie die Blutkörperchen aus den Blutproben durch Zentrifugation bei niedriger Temperatur und hoher Geschwindigkeit. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und entfernen Sie den Zellabfall durch Zentrifugation bei 16.000-facher G für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und extrahieren Sie die zirkulierende DNA mit einem kommerziellen Serum, während sie DNA-Extraktionskit zirkulieren.Kondensieren Sie das Volumen der zirkulierenden DNA auf 40 Mikroliter und speichern Sie es bei negativen 20 Grad Celsius. Führen Sie qPCR durch, um die zirkulierende schweinespezifische DNA zu quantifizieren. Porcine-spezifische Primer wurden entwickelt und verwendet, um zirkulierende schweinespezifische DNA durch qPCR zu quantifizieren, in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch, Transplantationsmodelle.Die Agaroseelektrophorese wurde verwendet, um verstärkte DNA-Fragmente zu isolieren. Mit PCR wurden die Primer-spezifisch für amplifizierte genomische DNA von Schweinen identifiziert. Als nächstes wurden die Spezifitäten dieser Primer in der Kohorte der Affen- oder menschlichen genomischen DNA oder in der Kohorte der genomischen DNA der Maus bestätigt.Schließlich wurden zwei artenspezifische Primer verwendet, um Schweine-DNA im Schweine-zu-Affen-Arterienpflaster und Schwein-zu-Maus-Zelltransplantationsmodelle zu verstärken. Das Wichtigste, was man sich beim Versuch dieses Protokolls merken sollte, ist, dass eine Kontamination aller Art verhindert werden sollte. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, neue Fragen innerhalb der Xenotransplantation zu erforschen, da es sich um eine einfache kostengünstige und nicht-invasive Methode zur Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantation handelt.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Forschung

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplantation von menschlichen Stammzellen in die Hühnerembryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...