Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית המחקר ודם המרכזית הלאומית של סין (2017YFC1103704), קרן שנג'ן למדע וטכנולוגיה (JCYJ20170817172116272), קרנות מיוחדות לבניית בתי חולים ברמה גבוהה בגואנגדונג מחוז (2019), פרויקט סנמינג לרפואה בשנזן (SZSM201412020), קרן לבניית משמעת רפואית ברמה גבוהה של שנזן (2016031638), קרן שנג'ן לבריאות ותכנון משפחה הוועדה (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים העם השני בשנזן, בית החולים המזוהה הראשון של אוניברסיטת שנזן.
1. עיצוב פריימרים ספציפיים לפורסין
<ol><li>לבצע ניתוח BLAST של הגנום כולו כדי לזהות גנים ספציפיים לפורצ'ין שהיו שונים מאלה של בני...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

כימות הדי.אן.איי במחזור ה-DNA מייצג גישה אפשרית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. גדי ואח '24 מצא כי תוכן DNA נגזר תורם (ddcfDNA) בדם של חולים עם דחייה חריפה היה גבוה באופן משמעותי מזה של חולים ללא דחייה. מחקרים אלה מראים כי ddcfDNA עשוי להיות סמן ביולוגי נפוץ לניטור נזק שתל איברים. ?...

כשל איברים הוא אחד הגורמים העיקרייםלמוות 1. השתלת תאים, רקמות ואיברים היא דרך יעילה לטיפול אי ספיקתאיברים 2. אף על פי כן, המחסור באיברים תורמים מגביל את היישום הקליני שלשיטה זו 3,4. מחקרים הראו כי חזירים יכולים לשמש כמקור פוטנציאלי של איברים אנושיים להשתלהקלינית 5,6. עם זאת, השתלת איברים בין מינים עומדת בפני דחייה חיסונית מסוכנת. לכן, זה קריטי כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. כיום, ניטור קליני של דחייה חיסונית תלוי בעיקר סימנים ותסמינים של המטופל, כמו גם בדיקות מעבדה (למשל, ביופסיה, ניתוח חיסוני,ואולטרסאונד) 7,8,9. עם זאת, שיטות ניטור אלה יש חסרונות רבים. הסימנים והתסמינים של דחייה חיסונית בחולים מופיעיםבדרך כלל מאוחר 10, אשר אינו מועיל גילוי מוקדם והתערבות מוקדמת; ביופסיה יש את החיסרון שללהיות פולשנית 11, וזה לא קל לחולים לקבל; ניתוח חיסוני חסר רגישות או ספציפיות, אולטרסאונד הוא עזר ויקר. לכן, דחוף למצוא שיטה יעילה ונוחה כדי לפקח על הדחייה החיסונית.
מחזור DNA הוא סוג extracellular של DNA נמצא בדם. מנדל ומטאיס12 דיווחו לראשונה על נוכחות של דנ"א במחזור בדם היקפי בשנת 1948. בתנאים פיזיולוגיים נורמליים, במחזור ה-DNA בדם של אנשים בריאים הוא נמוך יחסית בבסיס. עם זאת, בכמה פתולוגיות, כגון גידולים, אוטם שריר הלב, מחלות אוטואימוניות, ודחיית השתלה, רמת ה-DNA במחזור בדם יכול להיות גדל באופןמשמעותי 13,14 בשל שחרור מסיבי של DNA במחזור שנגרם על ידי אפופטוזיס ונמק. המקור של ה-DNA במחזור קשור אפופטוזיס ונמק15, אשר אופייניים של דחיית xenograft16.
במחזור DNA הוכח להיות סמן ביולוגי פולשנית לגילויסרטן 17,18,19. רצף גבוה של דנ"א במחזור נגזר תורם הוא אמין לזיהוי דחייה לאחר השתלתאיברים 20,21. עם זאת, שיטה זו דורשת ריכוז גבוה ואיכות של דנ"א שחולץ. דרישות ה-DNA בנוסף לעלות הגבוהה וצריכת זמן להפוך שיטה זו לבלתי זכאית לשימוש קליני שגרתי. ניתן לכמת במדויק את ה-DNA הנגזר מתורם על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR), שהוא גם ספציפי וגם רגיש. לכן, כימות ה-DNA במחזור porcine על ידי qPCR היא שיטה אפשרית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. זה פחות פולשני, רגיש מאוד וספציפי, בעלות נמוכה וחיסכון בזמן. חזירים בני אדם נפרדים גנטית עם רצפים גנומיים שונים לגמרי(איור 1). לכן, במחזור DNA porcine יכול להשתחרר לתוך הדם של הנמען לאחר השתלת קסנו בגלל דחיית קסנו. CpsDNA יכול להיות בדיוק לכמת על ידי qPCR עם פריימרים ספציפיים למינים בדם של הנמען. בעבר, הוכחנו את הרציונל והיתכנות של cpsDNA כסמן ביולוגי עבור xenotransplantation22,23. כאן, אנו חושפים טיפים ופרטים ניסיוניים נוספים. הניסוי מורכב מהצעדים הבאים. ראשית, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, ו-DNA גנומי היה מבודד, אשר שימשו כדי לאמת את הייחודיות של פריימרים על ידי PCR רגיל. שנית, בניית העקומה הסטנדרטית של cpsDNA וביוד cpsDNA מהדם המדגם. לבסוף, ה-DNA הספציפי לחזיר במחזור היה מכמת באמצעות qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

השתלת קסנו-השתלה היא שיטה אפשרית לטיפול בכישלון איברים. עם זאת, כיצד לפקח ביעילות על דחיית החיסון של xenotransplantation היא בעיה עבור רופאים וחוקרים. כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה כדי לפקח על דחייה חיסונית במודלים של השתלת תאי חזיר לעכבר ומודלים להשתלת תיקון עורק חזיר לקוף. במחזור הדנ"א הוא סמן ביולוגי לא פולשני לנזק לאיברים. במחקר זה, במחזור DNA ספציפי לחזיר (cpsDNA) היה במעקב במהלך דחיית xenograft על ידי PCR בזמן אמת כמותית (qPCR). בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. פריימרים ספציפיים למינים שימשו לאחר מכן לכמת cpsDNA על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף. הערך של שיטה זו מצביע על כך שניתן להשתמש בה כשיטה פשוטה, נוחה, בעלות נמוכה ופחות פולשנית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation.

בפרוטוקול זה תוכננו פריימרים ספציפיים לפורצ'ין, ונבנו שברי דנ"א ספציפיים המכילים פלסמידים, וקימורים סטנדרטיים לכמויות הוקמו(איור 4). מפרטי המינים של 19 פריימר אושרו על ידי PCR. פריימרים ספציפיים למינים (פריימר #4 ו-primer #11) שימשו לאחר מכן לכמת cpsDNA על ידי qPCR במודלים של השתלת תאי חז?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. באמצעות פריימרים ספציפיים למינים, cpsDNA היה לכמת על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף.

כימות של DNA ספציפי חזיר במחזור בדם של מודל xenotransplantation

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantation היא שיטה אפשרית לטיפול עם זאת, ניטור יעיל של הדחייה החיסונית של xenotransplantation היא בעיה עבור רופאים החוקרים. פרוטוקול זה הוא שיטה פשוטה, נוחה, בעלות נמוכה ופחות פולשנית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransmutation. טכניקה זו יכולה לשמש בתחום xenotransplantation, כולל השתלת איון חזיר לאדם, השתלת כליה, השתלת כבד והשתלת לב.התחל בהעברת 500 מיקרוליטרים של דגימות דם לצינורות מיקרו צנטריפוגה שונים. הוסף 20 microliters של פרוטאז K ו 500 microliters של מאגר תזה לתוך הצינורות. ואז ביסודיות לנער אותם לערבב.שים את הצינורות באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, מנער אותם פעמיים עד שלוש פעמים במהלך הדגירה עד הפתרון הופך ברור צנטריפוגה אותם בקצרה כדי להסיר את חרוזים נוזלי מן הקיר הפנימי של כיסויי הצינור. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של אלכוהול נטול מים, אתיל, ורעידות ביסודיות. מעבירים את התערובת לעמודת ההסתח.ואז צנטריפוגה העמוד במשך שתי דקות להשליך את נוזל הפסולת. הוסף 800 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה לכל עמודת סגיפה, וצנטריפוגה למשך דקה אחת. השאירו את העמודים בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות כדי לייבש את תותר השטיפת הנותר.מעבירים את עמודי הספיגה לצינור צנטריפוגלי נקי. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון לאמצע סרטי ההסחתה וממקמים אותם בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד חמש דקות, ואז צנטריפוגה אותם לדקה אחת. הכינו את תערובת המאסטר של PCR בהתאם לכיווני כתב היד, ולאחר מכן הוסיפו 23 מיקרוליטרים של התערובת לכל צינור מיקרו צנטריפוגה 0.6 מיליליטר.מוסיפים שני מיקרוליטרים של דנ"א גנומי לכל צינור ובזהירות קאבוט. ואז לערבב בקצרה צנטריפוגה. מניחים את הצינורות במחזור PCR ולהתחיל את ההגברה.כאשר התגובה היא סיימה לבצע אלקטרופורזה אגרוז. מוסיפים 1.2 גרם של אגרוז לתוך בקבוקון המכיל מאה מילימטרים של TAE ומרתיחים אותו במשך חמש דקות במיקרוגל. לאחר אגרוז התקרר כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף חמישה microliters של צבע חומצת גרעין לתוך הבקבוק, לאט, לשפוך אותו לתוך הצלחת ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מתמצק לתוך ג'ל.הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של כל דגימה וסולם דנ"א 2-Log או סמן דנ"א 1, לתוך הבארות של ג'ל אגרוז ואלקטרופורזה במזח של 120 מיליון עד שהרצועות מופרדות. דמיינו את הג'ל עם תמונה אולטרה סגולה. לאחר ביצוע טרנספורמציה כמתואר בכתב היד של הטקסט, אמת את הפלסמידים על ידי עיכול אנזימים של הגבלה כפולה עם EcoR I ו- Bam HI. הפרד את המוצרים המתעכלים עם אלקטרופורזה אגרוז 1% וחשוף את הג'ל לאור UV.מדללים את הפלסמיד המרוכז עם שבר ה-DNA של החזירים לפי שניים מ-10 עד ה-11 למיליליטר עבור הפתרון הסטנדרטי ההתחלתי, תוך שימוש במים מזוקקים כפולים. כדי ליצור עקומה סטנדרטית, הכינו תמהיל מאסטר qPCR, כמתואר בכתב היד של הטקסט והוסיפו 40 מיקרוליטרים של התערובת לכל צינור של רצועת שמונה צינורות. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של דנ"א סטנדרטי של ריכוזים שונים, מכסים את הצינורות ואז מערבבים אותם בקצרה וצנטריפוגים אותם.מניחים את הצינורות במכונת qPCR ולבצע את ההגברה. השתמש צינורות EDTA כדי לאסוף דגימות דם של כ 400 microliters ממודלים תיקון עורק חזיר-לקוף, או 100 microliters ממודלים השתלת תא חזיר לעכבר. ואז להעביר את הדגימות ל 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.הסר את תאי הדם מדגימות הדם על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה ומהירות גבוהה. העבר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G במשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש באורך 1.5 מיליליטר ומוציאים את הדנ"א המסתובב באמצעות סרום מסחרי תוך כדי הפצת ערכת מיצוי דנ"א.לדחוס את נפח ה-DNA במחזור ל 40 microliters ולאחסן אותו ב 20 מעלות צלזיוס שלילי. בצע qPCR לכמת את ה-DNA ספציפי חזיר במחזור. פריימרים ספציפיים לפורצ'ין תוכננו והשתמשו בהם כדי לכמת דנ"א ספציפי לחזיר במחזור על ידי qPCR, במודלים להשתלת תאי חזיר-עכבר ותיקון עורק חזיר-לקוף, מודלים להשתלה.אלקטרופורזה אגרוז שימשה לבידוד שברי דנ"א מוגברים. באמצעות PCR זוהו פריימרים ספציפיים לדנ"א גנומי מוגבר של פורצ'ין. לאחר מכן, מינים ספציפיים של פריימרים אלה בקבוצה של קוף או DNA גנומי אנושי או בקבוצה של DNA גנומי העכבר, אושרו.לבסוף, שני פריימרים ספציפיים למינים, שימשו להגברת הדנ"א של חזירים במדבקת העורק של חזיר-לקוף וחזיר לעכבר, מודלים להשתלת תאים. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה, הוא כי זיהום מכל הסוגים יש למנוע. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתוך xenotransplantation כי זה פשוט בעלות נמוכה ולא פולשנית שיטה כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

תמוגה אוטומטי Microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplantation בתאי גזע אנושיים לתוך העובר עוף

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...