Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nel Guangdong Provincia (2019), Sanming Project of Medicine a Shenzhen (SZSM201412020), Fondo per la costruzione di discipline mediche di alto livello di Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti dell'Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, Primo ospedale affiliato dell'Università di Shenzhen.
1. Progettare primer specifici per suini
<ol><li>Eseguire l'analisi BLAST dell'intero genoma per identificare geni specifici suiini diversi da quelli di esseri umani, scimmie o topi, utilizzando il software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).</li>
	<li>Progettare primer seco...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Quantificare il DNA circolante suina rappresenta un approccio fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. 24 hanno scoperto che il contenuto di DNA circolante derivato dal donatore (ddcfDNA) nel sangue dei pazienti con rigetto acuto era significativamente superiore a quello dei pazienti senza rifiuto. Questi studi suggeriscono che il ddcfDNA può essere un biomarcatore comune per il monitoraggio dei danni da innesto degli organi. Negli ultimi anni, qPCR è stato sempre pi?...

L'insufficienza d'organo è una delle principali cause dimorte 1. Il trapianto di cellule, tessuti e organi è un modo efficace per trattare l'insufficienzad'organo 2. Tuttavia, la carenza di organi donatori limita l'applicazione clinica di questometodo 3,4. Gli studi hanno dimostrato che i maiali possono essere utilizzati come potenziale fonte di organi umani per il trapiantoclinico 5,6. Tuttavia, il trapianto di organi tra specie deve affrontare un pericoloso rifiuto immunitario. Pertanto, è fondamentale monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto. Attualmente, il monitoraggio clinico del rigetto immunitario dipende principalmente dai segni e dai sintomi del paziente, nonché dai test di laboratorio (ad esempio biopsia, analisi immunobiochimica ed ecografia)7,8,9. Tuttavia, questi metodi di monitoraggio hanno molti svantaggi. I segni e i sintomi del rigetto immunitario nei pazienti di solitocompaiono alla fine del 10, il che non favorisce la diagnosi precoce e l'intervento precoce; la biopsia ha lo svantaggio di essereinvasiva 11, il che non è facile da accettare per i pazienti; l'analisi immunobiochimica manca di sensibilità o specificità e gli ultrasuoni sono ausiliari e costosi. Pertanto, è urgente trovare un metodo efficace e conveniente per monitorare il rifiuto immunitario.
Il DNA circolante è un tipo extracellulare di DNA trovato nel sangue. Mandel e Metais12 riportarono per la prima volta la presenza di DNA circolante nel sangue periferico nel 1948. In condizioni fisiologiche normali, il DNA circolante nel sangue di persone sane è relativamente basso al basale. Tuttavia, in alcune patologie, come tumori, infarto del miocardio, malattie autoimmuni e rigetto del trapianto, il livello di DNA circolante nel sangue può essere significativamenteaumentato 13,14 a causa del rilascio massiccio di DNA circolante causato da apoptosi e necrosi. L'origine del DNA circolante è associata all'apoptosi e alla necrosi15, che sono caratteristiche del rifiuto dello xenografto16.
Il DNA circolante ha dimostrato di essere un biomarcatore mini-invasivo per il rilevamento deitumori 17,18,19. Il sequenziamento elevato del DNA circolante derivato dal donatore è affidabile per il rilevamento del rigetto dopo il trapianto diorgani 20,21. Tuttavia, questo metodo richiede un'alta concentrazione e qualità del DNA estratto. I requisiti del DNA oltre all'elevato costo e al consumo di tempo rendono questo metodo non idoneo per l'uso clinico di routine. Il DNA circolante derivato dal donatore può essere quantificato con precisione dalla PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), che è allo stesso tempo specifica e sensibile. Pertanto, quantificare il DNA circolante suino mediante qPCR è un metodo fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. Questo è meno invasivo, altamente sensibile e specifico, a basso costo e risparmio di tempo. I suini e gli esseri umani sono geneticamente separati con sequenze genomiche molto diverse (Figura 1). Pertanto, il DNA suino circolante può essere rilasciato nel sangue del ricevente dopo lo xenotrapianto a causa dello xeno-rifiuto. CpsDNA potrebbe essere quantificato con precisione da qPCR con primer specifici per specie nel sangue del ricevente. In precedenza, abbiamo dimostrato la logica e la fattibilità del cpsDNA come biomarcatore per lo xenotrapianto22,23. Qui, divulghiamo suggerimenti e dettagli più sperimentali. L'esperimento consiste nei seguenti passaggi. In primo luogo, sono stati progettati primer specifici suiini e il DNA genomico è stato isolato, che è stato utilizzato per verificare la specificità dei primer dalla NORMALE PCR. In secondo luogo, costruire la curva standard di cpsDNA e isolare cpsDNA dal sangue campione. Infine, il DNA circolante specifico del maiale è stato quantificato utilizzando qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Lo xenotrapianto è un metodo fattibile per trattare l'insufficienza d'organo. Tuttavia, come monitorare efficacemente il rifiuto immunitario dello xenotrapianto è un problema per medici e ricercatori. Questo manoscritto descrive un metodo semplice ed efficace per monitorare il rigetto immunitario nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il DNA circolante è un biomarcatore potenzialmente non invasivo per il danno agli organi. In questo studio, il DNA circolante specifico del maiale (cpsDNA) è stato monitorato durante il rigetto dello xenograft mediante PCR quantitativo in tempo reale (qPCR). In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. I primer specifici per specie sono stati quindi utilizzati per quantificare il cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il valore di questo metodo suggerisce che può essere usato come metodo semplice, conveniente, a basso costo e meno invasivo per monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto.

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione(figura 4). Le specificità delle specie dei 19 primer sono state confermate dalla PCR. I primer specifici per specie (primer #4 e primer #11) sono stati quindi utilizzati per quantificare cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arte...

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Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. Utilizzando primer specifici per specie, cpsDNA è stato quantificato da qPCR in modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia.

Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Lo xenotrapianto è un metodo fattibile per trattare Tuttavia, un monitoraggio efficace del rigetto immunitario dello xenotrapianto è un problema per i medici e i ricercatori. Questo protocollo è un metodo semplice, conveniente, a basso costo e meno invasivo per monitorare il rifiuto immunitario della xenotrasmutazione. Questa tecnica può essere utilizzata nel campo dello xenotrapianto, tra cui il trapianto di isolotto da maiale a uomo, il trapianto di rene, il trapianto di fegato e il trapianto di cuore.Inizia trasferendo 500 microlitri di campioni di sangue in diversi tubi di micro centrifuga. Aggiungere 20 microlitri di proteasi K e 500 microlitri di tampone dilisi nei tubi. Quindi scuotirli accuratamente per mescolarli.Mettere i tubi in un bagno d'acqua a 56 gradi Celsius per 10 minuti, scuotendoli da due a tre volte durante l'incubazione fino a quando la soluzione non diventa chiara centrifugarli brevemente per rimuovere le perline liquide dalla parete interna dei coperchi del tubo. Quindi aggiungere 500 microlitri di anidro, alcol etilico e agitare accuratamente. Trasferire la miscela nella colonna di adsorbimento.Quindi centrifugare la colonna per due minuti e scartare il liquido di scarto. Aggiungere 800 microlitri di soluzione di risciacquo a ciascuna colonna di adsorbimento e centrifugare per un minuto. lasciare le colonne a temperatura ambiente per alcuni minuti per asciugare la soluzione di risciacquo rimanente.Trasferire le colonne di assorbimento in un tubo centrifugo pulito. Aggiungere 50 microlitri di tampone di eluizione al centro delle pellicole di adsorbimento e posizionarli a temperatura ambiente per due o cinque minuti, quindi centrifugarli per un minuto. Preparare il master mix PCR secondo le indicazioni manoscritte, quindi aggiungere 23 microlitri del mix in ogni tubo di microfuga da 0,6 millilitri.Aggiungere due microlitri di DNA genomico ad ogni tubo e cabot con cura. Quindi mescolare brevemente e centrifugare. Posizionare i tubi in un ciclore PCR e avviare l'amplificazione.Al termine della reazione eseguire l'elettroforesi di Agarosio. Aggiungere 1,2 grammi di Agarosio in un pallone contenente cento millimetri di TAE e far bollire per cinque minuti nel microonde. Una volta che l'agarosio si è raffreddato a circa 70 gradi Celsius, aggiungere cinque microlitri di colorante acido nucleico nel pallone, lentamente, versarlo nella piastra e lasciarlo a temperatura ambiente fino a quando non si solidifica in un gel.Aggiungere cinque microlitri di ogni campione e 2-Log DNA Ladder o DNA Marker 1, nei pozzi del gel di agarosio e dell'elettroforesi a 120 milioni di moli fino a quando le bande non sono separate. Visualizza il gel con un imager ultravioletto. Dopo aver eseguito la trasformazione come descritto nel manoscritto testuale, verificare i plasmidi mediante digestione enzimatica a doppia restrizione con EcoR I e Bam HI. Separare i prodotti digeriti con elettroforesi dell'1%Agarosio ed esporre il gel alla luce UV.Diluire il plasmide concentrato con il frammento di DNA suino a due volte 10 all'11a copia per millilitro per la soluzione standard di partenza, utilizzando acqua distillata doppia. Per stabilire una curva standard, preparare un master mix qPCR, come descritto nel manoscritto testuale e aggiungere 40 microlitri del mix in ogni tubo di una striscia a otto tubi. Aggiungere 10 microlitri di DNA standard di diverse concentrazioni, limitare i tubi, quindi mescolarli brevemente e centrifugarli.Posizionare i tubi nella macchina qPCR ed eseguire l'amplificazione. Utilizzare tubi EDTA per raccogliere campioni di sangue di circa 400 microlitri dai modelli di patch dell'arteria da maiale a scimmia o 100 microlitri dai modelli di trapianto di cellule da maiale a topo. Quindi trasferire i campioni in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri.Rimuovere le cellule del sangue dai campioni di sangue mediante centrifugazione a bassa temperatura e alta velocità. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 16.000 volte G per 10 minuti. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri ed estrarre il DNA circolante utilizzando un siero commerciale durante la circolazione del kit di estrazione del DNA.Condensare il volume del DNA circolante a 40 microlitri e conservarlo a -20 gradi Celsius. Eseguire qPCR per quantificare il DNA circolante specifico del maiale. I primer specifici dei suini sono stati progettati e utilizzati per quantificare il DNA circolante specifico del maiale da qPCR, nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia, modelli di trapianto.L'elettroforesi dell'agarosio è stata utilizzata per isolare frammenti di DNA amplificati. Utilizzando la PCR, sono stati identificati i primer specifici per il DNA genomico suino amplificato. Successivamente, sono state confermate le specificità delle specie di questi primer nella coorte di DNA genomico delle scimmie o umani o nella coorte del DNA genomico del topo.Infine, due primer specifici per specie, sono stati utilizzati per amplificare il DNA dei maiali nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia e dai maiali al topo, modelli di trapianto di cellule. La cosa più importante da ricordare durante il tentativo di questo protocollo è che la contaminazione di ogni tipo dovrebbe essere prevenuta. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare nuove domande all'interno dello xenotrapianto perché è un semplice metodo a basso costo e non invasivo per monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Automatizzato Microfluidic Lysis protocollo di sangue per l&#39;arricchimento di cellule nucleate circolanti

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Ricerca

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...