Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

이 작품은 중국 국립핵심R&D 프로그램(2017YFC103704), 심천과학기술재단(JCYJ20170817171116272), 광동성 고원병원 건립 특별기금(JCYJ2017171116272) 보조금으로 지원되었다. 2019), 심천의학의 산명 프로젝트(SZSM201412020), 심천 의 고수준 의료분야 건설 기금(2016031638), 심천보건가족기획위원회(SZXJ2017021) , SZXJ2018059).

모든 실험은 심천대학교 제1부산병원의 심천제병원 기관심사위원회의 관련 지침및 규정에 따라 수행되었다.
1. 디자인 돼지 특정 프라이머
<ol><li>소프트웨어 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 인간, 원숭이 또는 마우스의 유전자와 다른 돼지 특정 유전자를 식별하기 위해 전체 게놈 BLAST 분석을 수행합니다.</li>
	<li>프라이머 5의 소프트웨어를 사용하여 19개의 돼지 특이?...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

발신 순환 DNA를 정량화하는 것은 xenotransplantation의 면역 거부를 감시하는 실행 가능한 접근법을 나타냅니다. Gadi외. 24 급성 거부 환자의 혈액에서 기증자 유래 순환 DNA (ddcfDNA) 함량은 거부없이 환자의 함량이 상당히 높다는 것을 발견했다. 이 연구 결과는 ddcfDNA가 기관 이식 손상을 감시하기 위한 일반적인 biomarker일 지도 모르다는 것을 건의합니다. 최근에는 간단한 작동, 높은 수...

장기 실패는사망1의 주요 원인 중 하나입니다. 세포, 조직 및 장기의 이식은 장기 부전2를치료하는 효과적인 방법입니다. 그럼에도 불구하고, 기증자 기관의 부족은 이 방법의 임상 적용을제한3,4. 연구 결과에 따르면 돼지는 임상이식을위한 인간 장기의 잠재적 인 원천으로 사용될 수 있음을 보여 주었다5,6. 그러나, 종 간 장기 이식은 위험한 면역 거부에 직면. 따라서, xeno 이식의 면역 거부를 모니터링 하는 것이 중요 하다. 현재 면역 거부의 임상 모니터링은 주로 환자의 징후와 증상뿐만 아니라 실험실 테스트 (예를 들어, 생검, 면역 생화학 적 분석 및 초음파)7,8,9에의존한다. 그러나 이러한 모니터링 방법에는 많은 단점이 있습니다. 환자에 있는 면역 거부의 표시 그리고 현상은 일반적으로 조기 발견 및 조기 내정간섭에 도움이 되지 않는10의늦게 나타납니다; 생검은 환자가 받아들이기 쉽지 않은침습성 11의단점을 갖는다; 면역생화학적 분석은 민감성 또는 특이성이 부족하며 초음파는 보조적이고 비용이 많이 듭니다. 따라서 면역 거부를 모니터링하는 효과적이고 편리한 방법을 찾는 것이 시급하다.
순환 DNA는 혈액에서 찾아낸 DNA의 세포외 모형입니다. 만델과 메타이스12는 1948년에 말초 혈액에 있는 순환 DNA의 존재를 처음으로 보고했습니다. 정상적인 생리학적 조건하에서 건강한 사람들의 혈액에서 DNA를 순환하는 것은 기준선에서 상대적으로 낮습니다. 그러나, 종양, 심근 경색, 자가면역 질환 및 이식 거부와 같은 일부 병리학에서 혈액 내순환 DNA의 수준은 세포사멸 및 괴사증에 의한 순환 DNA의 대규모 방출로 인해13,14로 크게 증가할 수 있다. 순환 DNA의 기원은 자멸및괴사(15)와연관되며, 이는 이종이이식거부(16)의특징이다.
순환 DNA는 암 검출을 위한 최소침습바이오마커로 입증되었다17,18,19. 기증자 유래 순환 DNA의 높은 스루-풋 시퀀싱은 장기 이식 후 거부의 검출에 신뢰할 수있다(20,21). 그러나, 이 방법은 추출된 DNA의 고농도 및 질이 필요합니다. 높은 비용과 시간 소비 이외에 DNA 요구 사항은 이 방법을 일상적인 임상 사용을 위해 부적격하게 만듭니다. 기증자 유래 순환 DNA는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 정확하게 정량화될 수 있으며, 이는 특이적이고 민감합니다. 따라서 qPCR에 의한 순환 하는 돼지 순환 DNA를 정량화하는 것은 xenotransplantation의 면역 거부를 모니터링하는 실현 가능한 방법입니다. 이것은 덜 침습적이고, 매우 민감하고, 구체적이고, 저렴한 비용 및 시간 절약입니다. 돼지와 인간은 유전적으로 아주 다른 게놈 서열(도1)으로분리된다. 따라서, 순환 하는 돼지 DNA 는 xeno 거부 때문에 수신자의 혈액 후 xeno이식으로 풀어 놓일 수 있다. CpsDNA는 수신자의 혈액에 있는 종 특정 프라이머로 qPCR에 의해 정확하게 정량화될 수 있었습니다. 이전에는, 우리는 xeno 이식에 대한 바이오 마커로서 cpsDNA의 근거및 타당성을 입증했다22,23. 여기에서 는 더 많은 실험적 팁과 세부 사항을 공개합니다. 실험은 다음 단계로 구성됩니다. 첫째, 돼지 특이적 프라이머가 설계되었고, 일반 PCR에 의해 프라이머의 특이성을 검증하는 데 사용되었던 게놈 DNA가 분리되었다. 둘째, cpsDNA의 표준 곡선을 구성하고 샘플 혈액으로부터 cpsDNA를 격리합니다. 마지막으로, 순환돼지 특이적 DNA는 qPCR을 사용하여 정량화되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

제노이식은 장기 부전을 치료하는 실현 가능한 방법입니다. 그러나, xeno이식의 면역 거부를 효과적으로 감시하는 방법은 의사와 연구원을 위한 문제입니다. 이 원고는 돼지 대 마우스 세포 이식 모델 및 돼지 - 투 - 원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 면역 거부를 모니터링하는 간단하고 효과적인 방법을 설명합니다. 순환 DNA는 장기 손상을 위한 잠재적으로 비침습적인 바이오마커입니다. 이 연구에서는, 순환돼지 특이적 DNA(cpsDNA)는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 제노이식 거부 중에 모니터링되었다. 이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. 종별 프라이머는 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 cpsDNA를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 가치는 xeno이식의 면역 거부를 모니터링하기 위해 간단하고 편리하며 저렴한 비용 및 덜 침습적 인 방법으로 사용될 수 있음을 시사합니다.

본 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머가 설계되었고, 플라스미드 함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다(도4). 19프라이머의 종 특이성은 PCR에 의해 확인되었다. 종별 프라이머(프라이머 #4 및 프라이머 #11)는 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 cpsDNA를 정량화하는 데 사용되었다.
<p class...

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Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. cpsDNA는 종별 프라이머를 사용하여 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 정량화되었다.

제노이식 모델의 혈액에서 순환 돼지 특이적 DNA의 정량화

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

제노이식은 치료할 수 있는 가능한 방법이지만, 이노이식의 면역 거부를 효과적으로 모니터링하는 것은 의사와 연구자의 문제입니다. 이 프로토콜은 xenotransmutation의 면역 거부를 모니터링하는 간단하고 편리하며 저렴한 비용과 덜 침습적 인 방법입니다. 이 기술은 돼지 대 인간 적 정문 이식, 신장 이식, 간 이식 및 심장 이식을 포함하여 xeno 이식 분야에서 사용할 수 있습니다.혈액 샘플 500마이크로리터를 다른 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기는 것으로 시작합니다. 프로테아제 K 20 마이크로리터와 500마이크로리터의 용해 버퍼를 튜브에 넣습니다. 그런 다음 철저히 섞어 두십시오.튜브를 10분간 56도의 수조에 넣고, 용액이 투명해질 때까지 인큐베이션 중에 2~3회 흔들어 튜브 커버의 내부 벽에서 액체 구슬을 제거합니다. 그런 다음 Anhydrous, 에틸 알코올의 500 마이크로 리터를 추가하고 철저하게 흔들어. 혼합물을 흡착 열로 옮킨다.그런 다음 컬럼을 2분 동안 원심분리하고 폐액을 폐기합니다. 각 흡착 열에 800 마이크로리터의 헹구는 용액을 추가하고 원심분리기를 1분 동안 추가합니다. 남은 헹구는 용액을 건조시키기 위해 몇 분 동안 실온에서 열을 둡니다.흡수 컬럼을 깨끗한 원심 튜브로 옮기습니다. 흡착 필름 의 중간에 용출 버퍼 50 마이크로 리터를 추가하고 2 ~ 5 분 동안 실온에 배치 한 다음 원심 분리하여 1 분 동안 배치합니다. 원고 방향에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비한 다음 각 0.6 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 23 마이크로리터를 추가합니다.각 튜브에 게놈 DNA의 두 마이크로 리터를 추가하고 조심스럽게 Cabot. 그런 다음 잠시 혼합하고 원심분리기를 합니다. 튜브를 PCR 사이클러에 놓고 증폭을 시작합니다.반응이 끝나면 아가로즈 전기전도를 수행한다. 1.2 그램의 아가로즈를 100밀리미터의 TAE가 들어있는 플라스크에 넣고 전자레인지에서 5분간 끓입니다. 아가로즈가 섭씨 약 70도로 냉각되면, 5마이크로리터의 핵산 염료를 플라스크에 넣고 천천히 접시에 붓고 젤로 고화될 때까지 실온에서 둡니다.각 샘플의 5개의 마이크로리터와 2-Log DNA 사다리 또는 DNA 마커 1을 아가로즈 젤과 전기전도의 우물에 1억 2천만 부두에 추가하여 밴드가 분리될 때까지 넣습니다. 자외선 으로 젤을 시각화합니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 변환을 수행한 후 EcoR I 및 Bam HI를 통해 이중 제한 효소 소화로 플라스미드를 확인하십시오. 소화된 제품을 1%의 아가로즈 전기전구로 분리하고 젤을 자외선에 노출시다.농축 된 플라스미드를 돼지 DNA의 조각으로 2 배 10 에서 시작 표준 용액을 위해 밀리리터 당 11 번째 사본으로 희석하고 이중 증류수를 사용하십시오. 표준 곡선을 설정하려면 텍스트 원고에 설명된 대로 qPCR 마스터 믹스를 준비하고 8튜브 스트립의 각 튜브에 믹스 40 마이크로리터를 추가합니다. 다른 농도의 표준 DNA10 마이크로 리터를 추가, 튜브를 캡 다음 잠시 혼합하고 원심 분리.qPCR 기계에 튜브를 놓고 증폭을 수행합니다. EDTA 튜브를 사용하여 돼지-원숭이 동맥 패치 모델또는 돼지-마우스 세포 이식 모델에서 약 400마이크로리터의 혈액 샘플을 수집합니다. 그런 다음 샘플을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다.낮은 온도및 고속으로 원심분리에 의하여 혈액 샘플에서 혈액 세포를 제거합니다. 상체를 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 10분 동안 16, 000회 G에서 원심분리로 세포 이물질을 제거합니다. 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 전송하고 DNA 추출 키트를 순환하는 동안 상용 혈청을 사용하여 순환 DNA를 추출한다.순환 DNA의 양을 40 마이크로리터로 응축시키고 음의 섭씨 20도에 저장합니다. 순환하는 돼지 특이적 DNA를 정량화하기 위해 qPCR을 수행한다. 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치, 이식 모델에서 돼지-마우스 세포 이식 모델에서, qPCR에 의해 순환 돼지 특이적 DNA를 정량화하기 위해 돼지 특이적 프라이머를 설계하고 사용했습니다.아가로스 전기 포는 증폭 된 DNA 단편을 분리하는 데 사용되었습니다. PCR을 사용하여, 증폭된 돼지 게놈 DNA에 대한 프라이머 특이성이 확인되었다. 다음으로, 원숭이 또는 인간 게놈 DNA 의 코호트 또는 마우스 게놈 DNA의 코호트에서 이러한 프라이머의 종 특이성이 확인되었다.마지막으로 두 종 별 프라이머, 돼지 - 원숭이 동맥 패치및 돼지에서 돼지 DNA를 마우스, 세포 이식 모델로 증폭시키는 데 사용되었다. 이 프로토콜을 시도하는 동안 기억해야 할 가장 중요한 것은 모든 종류의 오염을 방지해야한다는 것입니다. 이 기술은 xeno 이식의 면역 거부를 감시하는 간단한 저가 및 비 침습적 인 방법이기 때문에 연구원이 xeno이식 내의 새로운 질문을 탐구하는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

연구

생물학

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

치킨의 배아에 인간 줄기 세포의 Xenotransplantation

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

쥐의 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...