Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Spesialfond for bygging av høyt nivå sykehus i Guangdong-provinsen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter fra Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University.
1. Design svin spesifikke primere
<ol><li>Utfør hele genom BLAST analyse for å identifisere svin spesifikke gener som var forskjellig fra de av mennesker, aper eller mus, ved hjelp av programvaren NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).</li>
	<li>Design primere i henhold til 19 grisespesifikke gener ...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Kvantifisering av svin sirkulerende DNA representerer en mulig tilnærming for å overvåke immunavvisningen av xenotransplantasjon. Gadi et al.24 fant at donoravledet sirkulerende DNA (ddcfDNA) innhold i blodet til pasienter med akutt avvisning var signifikant høyere enn for pasienter uten avvisning. Disse studiene tyder på at ddcfDNA kan være en vanlig biomarkør for overvåking av organtransplantatskade. De siste årene har qPCR i økende grad blitt brukt på analyse av nukleinsyrer på grun...

Organsvikt er en av de viktigste dødsårsakene1. Transplantasjon av celler, vev og organer er en effektiv måte å behandle organsvikt2på. Likevel begrenser mangelen på donororganer den kliniske anvendelsen av denne metoden3,4. Studier har vist at griser kan brukes som en potensiell kilde til menneskelige organer for klinisktransplantasjon 5,6. Organtransplantasjon på tvers av arter står imidlertid overfor farlig immunavvisning. Derfor er det avgjørende å overvåke immunavvisningen av xenotransplantation. For tiden avhenger klinisk overvåking av immunavvisning hovedsakelig av pasientens tegn og symptomer, samt laboratorietester (f.eks. biopsi, immunobiokjemisk analyse og ultralyd)7,8,9. Disse overvåkingsmetodene har imidlertid mange ulemper. Tegn og symptomer på immunavvisning hos pasienter vises vanligvissent 10, noe som ikke bidrar til tidlig deteksjon og tidlig intervensjon; biopsi har ulempen med å være invasiv11, noe som ikke er lett for pasienter å akseptere; immunobiokjemisk analyse mangler følsomhet eller spesifisitet, og ultralyd er ekstra og dyrt. Derfor er det presserende å finne en effektiv og praktisk metode for å overvåke immunavvisningen.
Sirkulerende DNA er en ekstracellulær type DNA som finnes i blod. Mandel og Metais12 rapporterte først tilstedeværelsen av sirkulerende DNA i perifert blod i 1948. Under normale fysiologiske forhold er sirkulerende DNA i blodet til friske mennesker relativt lav ved baseline. Men i noen patologier, som svulster, hjerteinfarkt, autoimmune sykdommer og transplantasjonsavvisning, kan nivået av sirkulerende DNA i blodet økesbetydelig 13,14 på grunn av den massive utgivelsen av sirkulerende DNA forårsaket av apoptose og nekrose. Opprinnelsen til sirkulerende DNA er forbundet med apoptose og nekrose15, som er karakteristiske for xenograft avvisning16.
Sirkulerende DNA har vist seg å være en minimal-invasiv biomarkør for å oppdage kreft17,18,19. Høy gjennom-sette sekvensering av donor-avledet sirkulerende DNA er pålitelig for påvisning av avvisning etterorgantransplantasjon 20,21. Denne metoden krever imidlertid en høy konsentrasjon og kvalitet på ekstrahert DNA. DNA-kravene i tillegg til høye kostnader og tidsforbruk gjør denne metoden ikke kvalifisert for rutinemessig klinisk bruk. Donoravledet sirkulerende DNA kan nøyaktig kvantifiseres ved kvantitativ sanntids-PCR (qPCR), som er både spesifikk og følsom. Kvantifisere svin sirkulerende DNA ved qPCR er derfor en mulig metode for å overvåke immunavvisning av xenotransplantasjon. Dette er mindre invasiv, svært følsom og spesifikk, lav pris og tidsbesparende. Griser og mennesker er genetisk separate med ganske forskjellige genomiske sekvenser (figur 1). Derfor kan sirkulerende svin DNA slippes ut i mottakerens blod etter xenotransplantasjon på grunn av xeno-avvisning. CpsDNA kan kvantifiseres nøyaktig av qPCR med artsspesifikke primere i mottakerens blod. Tidligere har vi demonstrert begrunnelsen og gjennomførbarheten av cpsDNA som biomarkør for xenotransplantation22,23. Her avslører vi mer eksperimentelle tips og detaljer. Eksperimentet består av følgende trinn. For det første ble svinespesifikke primere designet, og genomisk DNA ble isolert, som ble brukt til å verifisere spesifisiteten til primerne av vanlig PCR. For det andre, konstruere standard kurven av cpsDNA og isolere cpsDNA fra prøven blod. Til slutt ble det sirkulerende grisespesifikke DNA kvantifisert ved hjelp av qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Xenotransplantasjon er en mulig metode for å behandle organsvikt. Men hvordan å effektivt overvåke immunavvisningen av xenotransplantasjon er et problem for leger og forskere. Dette manuskriptet beskriver en enkel og effektiv metode for å overvåke immunavvisning i gris-til-mus celletransplantasjon modeller og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller. Sirkulerende DNA er en potensielt ikke-invasiv biomarkør for organskade. I denne studien ble sirkulerende grisespesifikt DNA (cpsDNA) overvåket under xenograft avvisning av kvantitativ sanntids-PCR (qPCR). I denne protokollen ble svinespesifikke primere designet, plasmider-inneholdende svinspesifikke DNA-fragmenter ble konstruert, og standardkurver for kvantitet ble etablert. Artsspesifikke primere ble deretter brukt til å kvantifisere cpsDNA av qPCR i celletransplantasjonsmodeller for gris-til-mus og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller. Verdien av denne metoden antyder at den kan brukes som en enkel, praktisk, lav pris og mindre invasiv metode for å overvåke immunavvisningen av xenotransplantasjon.

I denne protokollen ble svinespesifikke primere designet, plasmider-inneholdende svinspesifikke DNA-fragmenter ble konstruert, og standardkurver for kvantitet ble etablert (figur 4). Arter spesifisiteter av de 19 primere ble bekreftet av PCR. Artsspesifikke primere (primer #4 og primer #11) ble deretter brukt til å kvantifisere cpsDNA av qPCR i celletransplantasjonsmodeller for gris-til-mus og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller.
Agarose elektrofo...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

I denne protokollen ble svinespesifikke primere designet, plasmider-inneholdende svinspesifikke DNA-fragmenter ble konstruert, og standardkurver for kvantitet ble etablert. Ved hjelp av artsspesifikke primere ble cpsDNA kvantifisert av qPCR i celletransplantasjonsmodeller for gris-til-mus og gris-til-ape arterie patch transplantasjon modeller.

Kvantifisering av sirkulerende grisespesifikt DNA i blodet av en Xenotransplantasjonsmodell

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantation er en mulig metode for å behandle Men effektiv overvåking av immunavvisning av xenotransplantasjon er et problem for leger og forskerne. Denne protokollen er en enkel, praktisk, lav pris og mindre invasiv metode for å overvåke immunavvisningen av xenotransmutasjonen. Denne teknikken kan brukes i xenotransplantation feltet, inkludert gris-til-menneske holmetransplantasjon, nyretransplantasjon, levertransplantasjon og hjertetransplantasjon.Begynn med å overføre 500 mikroliter blodprøver til forskjellige mikrosentrigerør. Tilsett 20 mikroliter protease K og 500 mikroliter lysisbuffer i rørene. Deretter rister du dem grundig for å blande.Sett rørene i et vannbad på 56 grader Celsius i 10 minutter, rist dem to til tre ganger under inkubasjonen til løsningen blir klar sentrifuge dem kort for å fjerne de flytende perlene fra den indre veggen av rørdekslene. Tilsett deretter 500 mikroliter vannfri, etylalkohol og rist grundig. Overfør blandingen til adsorpsjonskolonnen.Sentrifuger deretter kolonnen i to minutter og kast avfallsvæsken. Legg til 800 mikroliter skylleløsning i hver adsorpsjonskolonne, og sentrifuge i ett minutt. la kolonnene stå ved romtemperatur i noen minutter for å tørke den gjenværende skylleløsningen.Overfør absorpsjonskolonnene til et rent sentrifugalrør. Legg til 50 mikroliter med elution buffer til midten av adsorpsjonsfilmene og plasser dem ved romtemperatur i to til fem minutter, og sentrifuger dem i ett minutt. Forbered PCR master mix i henhold til manuskriptretninger, og legg deretter til 23 mikroliter av blandingen i hver 0,6 milliliter mikro sentrifuge rør.Tilsett to mikroliter genomisk DNA til hvert rør og forsiktig Cabot. Deretter kort blande og sentrifuge. Plasser rørene i en PCR-cycler og start forsterkningen.Når reaksjonen er ferdig utføre Agarose elektroforese. Tilsett 1,2 gram Agarose i en kolbe som inneholder hundre millimeter TAE og kok den i fem minutter i mikrobølgeovnen. Når Agarose har avkjølt til ca 70 grader Celsius, tilsett fem mikroliter nukleinsyrefarge i kolben, sakte, hell den inn i platen og la den stå ved romtemperatur til den stivner inn i en gel.Legg til fem mikroliter av hver prøve og 2-Log DNA Ladder eller DNA 1, i brønnene til Agarose gel og elektroforese på 120 millioner brygge til båndene er skilt. Visualiser gelen med en ultrafiolett imager. Etter å ha utført transformasjon som beskrevet i tekstmanuskriptet, verifisere plasmidene ved dobbel begrensning enzym fordøyelse med EcoR I og Bam HI. Skill de fordøyde produktene med 1% Agarose elektroforese og utsett gelen for UV-lys.Fortynn konsentrert plasmid med fragmentet av svin DNA til to ganger 10 til 11th kopier per milliliter for startstandardløsningen, Bruke dobbelt destillert vann. For å etablere en standardkurve, lag en qPCR master mix, som beskrevet i tekstmanuskriptet og legg til 40 mikroliter av blandingen i hvert rør på en åtte-rørs stripe. Tilsett 10 mikroliter standard DNA av forskjellige konsentrasjoner, cap rørene deretter kort blande og sentrifuge dem.Plasser rørene i qPCR-maskinen og utfør forsterkningen. Bruk EDTA-rør til å samle blodprøver av ca 400 mikroliter fra gris-til-ape arterie patch modeller, eller 100 mikroliter fra gris-til-mus celle transplantasjon modeller. Deretter overfører prøvene til 1,5 milliliter sentrifugerør.Fjern blodcellene fra blodprøvene ved sentrifugering ved lav temperatur og høy hastighet. Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør på 1,5 milliliter og fjern celleavfallet ved sentrifugering ved 16 000 ganger G i 10 minutter. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 milliliter sentrifugerør og trekk ut det sirkulerende DNA ved hjelp av et kommersielt serum mens du sirkulerer DNA-ekstraksjonssett.Kondenser volumet av sirkulerende DNA til 40 mikroliter og lagre det ved negative 20 grader Celsius. Utfør qPCR for å kvantifisere det sirkulerende grisespesifikke DNA-et. Svinspesifikke primere ble designet og brukt til å kvantifisere sirkulerende grisspesifikt DNA av qPCR, i gris-til-mus celletransplantasjon modeller og gris-til-ape arterie patch, transplantasjon modeller.Agarose elektroforese ble brukt til å isolere forsterkede DNA-fragmenter. Ved hjelp av PCR ble primers-spesifikk for forsterket svin genomisk DNA identifisert. Deretter ble arter spesifisiteter av disse primers i kohorten av ape eller human genomisk DNA eller i kohorten av mus genomisk DNA, bekreftet.Til slutt to arter-spesifikke primere, ble brukt til å forsterke gris DNA i gris-til-ape arterie patch og gris til mus, celletransplantasjon modeller. Det viktigste å huske på mens du prøver denne protokollen, er at forurensning av alle slag bør forebygges. Denne teknikken baner vei for forskere å utforske nye spørsmål innen xenotransplantation fordi det er en enkel rimelig og ikke-invasiv metode for å overvåke immunavvisning av xenotransplantasjon.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisering av DNA Replication i Vertebrate Model System DT40 hjelp av DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging av Enkelt Engineered RNA transkripsjoner i levende celler ved hjelp Proporsjonellekspansjon bimolekylære Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Prøvetaking Blod fra Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...