Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de P&D da China (2017YFC1103704), Fundação Shenzhen de Ciência e Tecnologia (JCYJ2017081717216272), Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível em Guangdong Província (2019), Projeto de Medicina de Sanming em Shenzhen (SZSM201412020), Fundo para Construção de Disciplina Médica de Alto Nível de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes do Conselho de Revisão Institucional do Hospital do Segundo Povo de Shenzhen, Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Shenzhen.
1. Projete primers específicos de suínos
<ol><li>Realize a análise blast de genoma inteiro para identificar genes específicos suínos que eram diferentes dos humanos, macacos ou camundongos, usando o software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).</li>
	<li>Projete primers ...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Quantificar o DNA circulante de suínos representa uma abordagem viável para monitorar a rejeição imune da xenotransplante. Gadi et al.24 descobriram que o conteúdo de DNA circulante derivado do doador (ddcfDNA) no sangue de pacientes com rejeição aguda foi significativamente maior do que o de pacientes sem rejeição. Esses estudos sugerem que o DDCFDNA pode ser um biomarcador comum para monitorar danos ao enxerto de órgãos. Nos últimos anos, a QPCR tem sido cada vez mais aplicada à an?...

A falência de órgãos é uma das principais causas de morte1. O transplante de células, tecidos e órgãos é uma forma eficaz de tratar a falência de órgãos2. No entanto, a escassez de órgãos doadores limita a aplicação clínica deste método3,4. Estudos têm demonstrado que os suínos podem ser usados como fonte potencial de órgãos humanos para transplante clínico5,6. No entanto, o transplante de órgãos entre espécies enfrenta perigosa rejeição imunológica. Portanto, é crucial monitorar a rejeição imune da xenotransplante. Atualmente, o acompanhamento clínico da rejeição imunológica depende principalmente dos sinais e sintomas do paciente, bem como de exames laboratoriais (por exemplo, biópsia, análise imunobioquímica e ultrassom)7,8,9. No entanto, esses métodos de monitoramento têm muitas desvantagens. Os sinais e sintomas de rejeição imunológica em pacientes geralmente aparecem no finaldo dia 10, o que não é propício à detecção precoce e intervenção precoce; a biópsia tem a desvantagem de ser invasiva11, o que não é fácil para os pacientes aceitarem; a análise imunobioquímica carece de sensibilidade ou especificidade, e o ultrassom é auxiliar e caro. Portanto, é urgente encontrar um método eficaz e conveniente para monitorar a rejeição imunológica.
O DNA circulante é um tipo extracelular de DNA encontrado no sangue. Mandel e Metais12 relataram pela primeira vez a presença de DNA circulante em sangue periférico em 1948. Sob condições fisiológicas normais, o DNA circulante no sangue de pessoas saudáveis é relativamente baixo na linha de base. No entanto, em algumas patologias, como tumores, infarto do miocárdio, doenças autoimunes e rejeição de transplantes, o nível de DNA circulante no sangue pode ser significativamente aumentado13,14 devido à liberação maciça de DNA circulante causado por apoptose e necrose. A origem do DNA circulante está associada à apoptose e necrose15, características da rejeição do xenoenxerto16.
O DNA circulante tem sido provado ser um biomarcador minimamente invasivo para detectar cânceres17,18,19. O alto sequenciamento do DNA circulante derivado do doador é confiável para a detecção da rejeição após o transplante deórgãos 20,21. No entanto, este método requer uma alta concentração e qualidade de DNA extraído. Os requisitos de DNA, além do alto custo e do consumo de tempo, tornam esse método inelegível para uso clínico de rotina. O DNA circulante derivado do doador pode ser precisamente quantificado por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), que é específico e sensível. Portanto, quantificar o DNA circulante de suínos por qPCR é um método viável para monitorar a rejeição imune da xenotransplante. Isso é menos invasivo, altamente sensível e específico, de baixo custo e economia de tempo. Porcos e seres humanos são geneticamente separados com sequências genômicas bastante diferentes(Figura 1). Portanto, o DNA suíno circulante pode ser liberado no sangue pós-xenotransplante do receptor por causa da rejeição de xenoxe. O CPSDNA poderia ser precisamente quantificado por qPCR com primers específicos de espécies no sangue do receptor. Anteriormente, demonstramos a lógica e a viabilidade do CPSDNA como biomarcador para xenotransplante22,23. Aqui, divulgamos mais dicas e detalhes experimentais. O experimento consiste nos seguintes passos. Em primeiro lugar, foram projetados primers específicos porcina, e o DNA genômico foi isolado, que foram usados para verificar a especificidade dos primers por PCR regular. Em segundo lugar, a construção da curva padrão do CPSDNA e isolação do cpsDNA do sangue amostral. Finalmente, o DNA específico do porco circulante foi quantificado por meio de qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Xenotransplante é um método viável para tratar a falência de órgãos. No entanto, como monitorar efetivamente a rejeição imune do xenotransplante é um problema para médicos e pesquisadores. Este manuscrito descreve um método simples e eficaz para monitorar a rejeição imunológica em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco. O DNA circulante é um biomarcador potencialmente não invasivo para danos nos órgãos. Neste estudo, o DNA específico do suíno circulante (cpsDNA) foi monitorado durante a rejeição do xenoenxerto por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas. Primers específicos de espécies foram então usados para quantificar cpsDNA por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco. O valor deste método sugere que ele pode ser usado como um método simples, conveniente, de baixo custo e menos invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransplante.

Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas(Figura 4). As especificidades das espécies dos 19 primers foram confirmadas pela PCR. Primers específicos de espécies (primer #4 e primer #11) foram então usados para quantificar cpsDNA por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de re...

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Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas. Utilizando primers específicos de espécies, o CPSDNA foi quantificado por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco.

Quantificação do DNA específico do porco circulante no sangue de um modelo de xenotransplante

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplante é um método viável para tratar No entanto, o monitoramento efetivo da rejeição imune do xenotransplante é um problema para médicos e pesquisadores. Este protocolo é um método simples, conveniente, de baixo custo e menos invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransmutação. Essa técnica pode ser usada no campo do xenotransplante, incluindo transplante de ilhotas de porco para humano, transplante de rim, transplante de fígado e transplante de coração.Comece transferindo 500 microliters de amostras de sangue para diferentes tubos de microcrífugas. Adicione 20 microliters de protease K e 500 microliters de tampão de lise nos tubos. Em seguida, agite-os completamente para misturar.Coloque os tubos em um banho de água a 56 graus Celsius por 10 minutos, sacudindo-os duas a três vezes durante a incubação até que a solução fique clara centrífuga-los brevemente para remover as contas líquidas da parede interna das tampas do tubo. Em seguida, adicione 500 microliters de Anidro, Álcool Etílico e agite bem. Transfira a mistura para a coluna de adsorção.Em seguida, centrifufique a coluna por dois minutos e descarte o líquido de resíduos. Adicione 800 microliters de solução de enxágue a cada coluna de adsorção e centrífuga por um minuto. Deixe as colunas em temperatura ambiente por alguns minutos para secar a solução restante de lavagem.Transfira as colunas de absorção para um tubo centrífugo limpo. Adicione 50 microliters de tampão de elução ao meio dos filmes de adsorção e coloque-os em temperatura ambiente por dois a cinco minutos, depois centrifuá-los por um minuto. Prepare a mistura mestre pcr de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, adicione 23 microliters da mistura em cada tubo de micro centrífugas de 0,6 mililitro.Adicione dois microliters de DNA genômico a cada tubo e cuidadosamente Cabot. Em seguida, misture brevemente e centrífuga. Coloque os tubos em um ciclofaixador PCR e inicie a amplificação.Quando a reação terminar, realize a agarose eletroforese. Adicione 1,2 gramas de Agarose em um frasco contendo cem milímetros de TAE e ferva-o por cinco minutos no micro-ondas. Uma vez que a Agarose tenha esfriado a aproximadamente 70 graus Celsius, adicione cinco microliters de corante de ácido nucleico no frasco, lentamente, despeje-o na placa e deixe-o em temperatura ambiente até que se solidifique em um gel.Adicione cinco microliters de cada amostra e 2-Log DNA Ladder ou DNA Marker 1, nos poços do gel agarose e eletroforese em 120 milhões de píer até que as bandas sejam separadas. Visualize o gel com um imager ultravioleta. Após realizar a transformação conforme descrito no manuscrito do texto, verifique os plasmídeos por dupla restrição de digestão enzimática com EcoR I e Bam HI. Separe os produtos digeridos com eletroforese 1%Agarose e exponha o gel à luz UV.Diluir o plasmídeo concentrado com o fragmento de DNA suíno para duas vezes 10 a 11 cópias por mililitro para a solução padrão inicial, Usando água dupla destilada. Para estabelecer uma curva padrão, prepare uma mistura mestre qPCR, conforme descrito no manuscrito do texto e adicione 40 microliters da mistura em cada tubo de uma tira de oito tubos. Adicione 10 microliters de DNA padrão de diferentes concentrações, tampa os tubos e, em seguida, misture-os brevemente e centrífuga-los.Coloque os tubos na máquina qPCR e realize a amplificação. Use tubos EDTA para coletar amostras de sangue de cerca de 400 microliters dos modelos de remendo da artéria de porco para macaco, ou 100 microliters dos modelos de transplante de células de porco para rato. Em seguida, transfira as amostras para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.Remova as células sanguíneas das amostras de sangue por centrifugação a baixa temperatura e alta velocidade. Transfira o supernante para um novo tubo centrífuga de 1,5 mililitros e remova os detritos celulares por centrifugação a 16.000 vezes G por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e extraia o DNA circulante usando um soro comercial enquanto circulava o kit de extração de DNA.Condensar o volume de DNA circulante para 40 microliters e armazená-lo a 20 graus Celsius negativos. Realize qPCR para quantificar o DNA específico do porco circulante. Primers específicos de suínos foram projetados e usados para quantificar DNA específico de porco circulante por qPCR, em modelos de transplante de células de porco para rato e patch de artéria de porco para macaco, modelos de transplante.A eletroforese agarose foi usada para isolar fragmentos de DNA amplificados. Utilizando PCR, foram identificados os primers específicos para DNA genômico porcina amplificada. Em seguida, foram confirmadas as especificidades dessas primers na coorte de dna genômico de macacos ou humanos ou na coorte de DNA genômico do rato.Finalmente, dois primers específicos de espécies foram usados para amplificar o DNA de porco no patch da artéria de porco para macaco e modelos de transplante de células. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este protocolo é que a contaminação de todos os tipos deve ser evitada. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem novas questões dentro da xenotransplante, pois é um método simples de baixo custo e não invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransplante.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Protocolo de Lise automatizado microfluídicos de sangue para Enriquecimento de células nucleadas circulantes

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplante de células-tronco humanas no embrião de galinha

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...