Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Национальной ключевой программы НИОКР Китая (2017YFC1103704), Шэньчжэньского фонда науки и техники (JCYJ20170817172116272), специальных фондов для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун (2019), Санминг-проект медицины в Шэньчжэне (SSM201412020), Фонд высокого уровня медицинской дисциплины Строительство Шэньчжэня (2016031638), Шэньчжэнь Фонд здравоохранения и планирования семьи комиссии (S'XJ2017021 , S'XJ2018059).

Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями Институционального совета по обзору Шэньчжэньской второй народной больницы, Первой аффилированной больницы Шэньчжэньского университета.
1. Дизайн свиной конкретных г...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Количественная оценка распространяемой ДНК свиней представляет собой осуществимый подход к мониторингу иммунного отторжения ксенотрансплантации. Гади и др.24 обнаружили, что содержание циркулирующей ДНК (ddcfDNA) в крови пациентов с острым отторжением было значительно выше,...

Органная недостаточность является одной из основных причин смерти1. Трансплантация клеток, тканей и органов является эффективным способом лечения органной недостаточности2. Тем не менее, нехватка донорских органов ограничивает клиническое применение этогометода 3,4. Исследования показали, что свиньи могут быть использованы в качестве потенциального источника человеческих органов для клиническойтрансплантации 5,6. Однако пересадка меж вида органов сталкивается с опасным иммунным отторжением. Поэтому крайне важно контролировать иммунный отказ от ксенотрансплантации. В настоящее время клинический мониторинг иммунного отторжения в основном зависит от признаков и симптомов пациента, а также лабораторных тестов (например, биопсия, иммунобиохимический анализ иУЗИ) 7,8,9. Однако эти методы мониторинга имеют много недостатков. Признаки и симптомы иммунного отторжения у пациентов обычнопоявляются поздно 10, что не способствует раннему выявлению и раннему вмешательству; биопсия имеет недостаток бытьинвазивным 11, что не легко для пациентов, чтобы принять; иммунобиохимический анализ не хватает чувствительности или специфичности, а УЗИ является вспомогательным и дорогостоящим. Поэтому необходимо срочно найти эффективный и удобный метод контроля иммунного отторжения.
Циркулирующая ДНК является внеклеточным типом ДНК, найденной в крови. Мандель и Метаис12 впервые сообщили о наличии циркулирующей ДНК в периферической крови в 1948 году. В нормальных физиологических условиях, циркулирующих ДНК в крови здоровых людей является относительно низким на базовом уровне. Однако, в некоторых патологиях, таких как опухоли, инфаркт миокарда, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантации, уровень циркулирующей ДНК вкрови может быть значительно увеличен на 13,14 из-за массового высвобождения циркулирующей ДНК, вызванной апоптозом и некрозом. Происхождение циркулирующей ДНК связано с апоптозом и некрозом15,которые характерны для отторжения ксенотрансплантата16.
Циркулирующие ДНК было доказано, что минимально инвазивных биомаркер для обнаружениярака 17,18,19. Высокое секвенирование циркулирующей ДНК доноров является надежным для выявления отторжения послетрансплантации органов 20,21. Однако этот метод требует высокой концентрации и качества извлеченной ДНК. Требования к ДНК в дополнение к высокой стоимости и времени потребления делают этот метод неподходящим для регулярного клинического использования. Циркулирующая ДНК, полученная донорами, может быть точно количественно оценена количественным ПЦР в режиме реального времени (qPCR), который является одновременно специфическим и чувствительным. Таким образом, количественная оценка свиной циркулирующей ДНК с помощью qPCR является возможным методом мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации. Это менее инвазивные, очень чувствительные и конкретные, низкая стоимость, и экономия времени. Свиньи и люди генетически отделены с совершенно разными геномными последовательностями(рисунок 1). Таким образом, циркулирующая ДНК свинины может быть выпущена в кровь получателя после ксенотрансплантации из-за ксено-отторжения. CpsDNA может быть точно количественно qPCR с видом конкретных грунтовки в крови получателя. Ранее мы продемонстрировали обоснование и осуществимость CPSDNA в качестве биомаркера для ксенотрансплантации22,23. Здесь мы раскрываем более экспериментальные советы и детали. Эксперимент состоит из следующих шагов. Во-первых, были разработаны свиные специфические грунтовки, и геномная ДНК была изолирована, которые использовались для проверки специфичности грунтовки обычным ПЦР. Во-вторых, построение стандартной кривой cpsDNA и изоляции cpsDNA от образца крови. Наконец, циркулирующая ДНК свиней была количественно оценена с помощью qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Ксенотрансплантация является возможным методом лечения органной недостаточности. Однако, как эффективно контролировать иммунный отказ от ксенотрансплантации является проблемой для врачей и исследователей. В этой рукописи описывается простой и эффективный метод мониторинга иммунного отторжения в моделях трансплантации клеток от свиньи до мыши и моделях трансплантации патчей от свиньи к обезьяне. Циркулирующая ДНК является потенциально неинвазивным биомаркером для повреждения органов. В этом исследовании, циркулирующих свиней конкретных ДНК (cpsDNA) был мониторинг во время ксенотрансплантата отторжения количественных ПЦР в режиме реального времени (qPCR). В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, построены плазмиды, содержащие свиные фрагменты ДНК, и установлены стандартные кривые для количественной оценки. Вид-специфические грунтовки затем были использованы для количественной cpsDNA по qPCR в свинью к мыши модели трансплантации клеток и свиньи до обезьяны артерии патч трансплантации моделей. Значение этого метода предполагает, что он может быть использован в качестве простого, удобного, недорогого и менее инвазивного метода для мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации.

В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, плазмиды, содержащие свиной специфические фрагменты ДНК, и были установлены стандартные кривые для количественнойоценки (рисунок 4). Специфика видов 19 грунтовок была подтверждена ПЦР. Вид-специфические ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, построены плазмиды, содержащие свиные фрагменты ДНК, и установлены стандартные кривые для количественной оценки. Используя вид-специфические грунтовки, cpsDNA было количественно qPCR в моделях трансплантации клетки свиньи к мыши и свинья-к-обезьяна модели трансплантации артерии.

Количественная оценка циркулирующей ДНК свиней в крови модели ксенотрансплантации

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Ксенотрансплантация является возможным методом для лечения Однако, эффективный мониторинг иммунного отторжения ксенотрансплантации является проблемой для врачей и исследователей. Этот протокол является простым, удобным, недорогим и менее инвазивным методом контроля иммунного отторжения ксенотрансмутации. Этот метод может быть использован в области ксенотрансплантации, включая пересадку островка от свиньи человеку, трансплантацию почек, пересадку печени и пересадку сердца.Начните с переноса 500 микролитров образцов крови в различные микро центрифуги труб. Добавьте в трубки 20 микролитров протеазы K и 500 микролитров буфера лиза. Затем тщательно встряхнуть их, чтобы смешать.Положите трубки в водяной бане при 56 градусах по Цельсию в течение 10 минут, встряхивая их два-три раза во время инкубации, пока раствор не станет ясно центрифуги их кратко удалить жидкие бусы с внутренней стенки трубки охватывает. Затем добавьте 500 микролитров ангидроуса, этилового спирта и тщательно встряхните. Перенесите смесь в колонку adsorption.Затем центрифуга колонны в течение двух минут и отказаться от отходов жидкости. Добавьте 800 микролитров раствора для полоскания в каждую колонку adorption и центрифугу в течение одной минуты. оставьте колонны при комнатной температуре на несколько минут, чтобы высушить оставшийся раствор полоскания.Перенесите абсорбционные столбцы в чистую центробежную трубку. Добавьте 50 микролитров буфера elution к середине пленки adorption и поместите их при комнатной температуре в течение двух-пяти минут, затем центрифуга их в течение одной минуты. Подготовь мастер-микс ПЦР в соответствии с рукописными указаниями, а затем добавьте 23 микролитров смеси в каждую микро центрифугу на 0,6 миллилитров.Добавьте два микролитров геномной ДНК в каждую трубку и тщательно Cabot. Затем кратко перемешать и центрифугу. Поместите трубки в циклер ПЦР и запустите усиление.Когда реакция закончена выполнить агароз электрофорез. Добавьте 1,2 грамма агарозы в колбу, содержащую сто миллиметров TAE и варить его в течение пяти минут в микроволновой печи. После того, как агароза остынет примерно до 70 градусов по Цельсию, добавить пять микролитров нуклеиновой кислоты красителя в колбу, медленно, залить его в тарелку и оставить его при комнатной температуре, пока он не затвердевает в гель.Добавьте пять микролитров каждого образца и 2-Log DNA Ladder или DNA Marker 1 в колодцы геля Агарозы и электрофореза на 120-миллионном пирсе до тех пор, пока полосы не будут разделены. Визуализуй гель с ультрафиолетовым изображением. После выполнения трансформации, описанной в рукописи текста, проинстимите плазмиды двойным ограничением переваривания ферментов с помощью EcoR I и Bam HI. Разделив переваренные продукты электрофорезом 1%Agarose и подвергайте гель ультрафиолетовому свету.Разбавить концентрированную плазмиду фрагментом свиной ДНК в два раза от 10 до 11 копий на миллилитр для стартового стандартного раствора, используя двойную дистиллированную воду. Чтобы установить стандартную кривую, подготовь мастер-микс qPCR, как описано в текстовой рукописи, и добавьте 40 микролитров смеси в каждую трубку восьмитрубной полосы. Добавьте 10 микролитров стандартной ДНК различных концентраций, крышка труб затем кратко перемешать и центрифуги их.Поместите трубки в машину qPCR и выполните усиление. Используйте трубки EDTA для сбора образцов крови около 400 микролитров от свиньи до обезьяны модели патч артерии, или 100 микролитров от свиньи до мыши модели трансплантации клеток. Затем перенесите образцы на 1,5 миллилитровые центрифуги.Удалите клетки крови из образцов крови путем центрифугации при низкой температуре и высокой скорости. Перенесите супернатант в новую центрифугу 1,5 миллилитров и удалите клеточный мусор путем центрифугации в 16 000 раз G в течение 10 минут. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую центрифугу и извлекайте циркулирующую ДНК с помощью коммерческой сыворотки, распространяя при этом набор для извлечения ДНК.Конденсировать объем циркулирующей ДНК до 40 микролитров и хранить его при отрицательном 20 градусов по Цельсию. Выполните qPCR для количественной оценки циркулирующих свиней конкретных ДНК. Свинина конкретных грунтовки были разработаны и использованы для количественной оценки циркулирующих свиней конкретных ДНК по qPCR, в свиней к мыши модели трансплантации клеток и свиньи до обезьяны артерии патч, трансплантации моделей.Электрофорез агароза использовался для изоляции усиленных фрагментов ДНК. С помощью ПЦР были определены праймеры, специфичные для усиленной геномной ДНК свиней. Затем были подтверждены виды этих грунтовок в когорте геномной ДНК обезьяны или человека или в когорте геномной ДНК мыши.Наконец, два вида конкретных грунтовки, были использованы для усиления ДНК свиньи в свиней до обезьяны артерии патч и свиньи к мыши, модели трансплантации клеток. Самое главное помнить при попытке этого протокола, является то, что загрязнение всех видов должны быть предотвращены. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы исследовать новые вопросы в рамках ксенотрансплантации, потому что это простой недорогой и неинвазивный метод для мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Автоматизированная микрожидкостных протокол Лизис кровь для обогащения Циркуляционные ядерных клеток

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Ксенотрансплантация из стволовых клеток человека в куриный эмбрион

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Визуализация репликации ДНК в позвоночных DT40 Модель системы с использованием техники ДНК-волоконной

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Забор крови из боковой хвостовой вены крыс

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...