Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de I+D clave de China (2017YFC1103704), Fundación de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JCYJ20170817172116272), Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en Guang Provincia dedong (2019), Sanming Project of Medicine en Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Junta de Revisión Institucional del Hospital del Segundo Pueblo de Shenzhen, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Shenzhen.
1. Diseñar imprimaciones específicas porcinas
<ol><li>Realizar análisis BLAST del genoma completo para identificar genes específicos porcinos que eran diferentes de los de los seres humanos, monos o ratón, utilizando el software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

La cuantificación del ADN circulante porcino representa un enfoque factible para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante. 24 encontraron que el contenido de ADN circulante derivado de donantes (ddcfDNA) en la sangre de pacientes con rechazo agudo era significativamente mayor que el de los pacientes sin rechazo. Estos estudios sugieren que el ddcfDNA puede ser un biomarcador común para monitorear el daño del injerto de órganos. En los últimos años, qPCR se ha aplicado cada vez más al...

La insuficiencia orgánica es una de las principales causas de muerte1. El trasplante de células, tejidos y órganos es una forma eficaz de tratar la insuficiencia orgánica2. Sin embargo, la escasez de órganos donantes limita la aplicación clínica de este método3,4. Los estudios han demostrado que los cerdos pueden ser utilizados como una fuente potencial de órganos humanos para el trasplante clínico5,6. Sin embargo, el trasplante de órganos entre especies se enfrenta a un rechazo inmune peligroso. Por lo tanto, es crucial controlar el rechazo inmune del xenotrasplante. Actualmente, el monitoreo clínico del rechazo inmune depende principalmente de los signos y síntomas del paciente, así como de las pruebas de laboratorio (por ejemplo, biopsia, análisis inmunobioquímico y ultrasonido)7,8,9. Sin embargo, estos métodos de supervisión tienen muchas desventajas. Los signos y síntomas del rechazo inmune en los pacientes suelen aparecer a finales de10,lo que no es propicio para la detección temprana y la intervención temprana; biopsia tiene la desventaja de ser invasivo11, lo que no es fácil de aceptar para los pacientes; el análisis inmunobioquímico carece de sensibilidad o especificidad, y el ultrasonido es auxiliar y costoso. Por lo tanto, es urgente encontrar un método eficaz y conveniente para monitorear el rechazo inmune.
El ADN circulante es un tipo extracelular de ADN que se encuentra en la sangre. Mandel y Metais12 informaron por primera vez de la presencia de ADN circulante en la sangre periférica en 1948. En condiciones fisiológicas normales, el ADN circulante en la sangre de personas sanas es relativamente bajo al inicio. Sin embargo, en algunas patologías, como tumores, infarto de miocardio, enfermedades autoinmunes y rechazo de trasplantes, el nivel de ADN circulante en la sangre puede aumentar significativamente13,14 debido a la liberación masiva de ADN circulante causado por apoptosis y necrosis. El origen del ADN circulante se asocia con la apoptosis y la necrosis15,que son características del rechazo del xenoinjerto16.
Se ha demostrado que el ADN circulante es un biomarcador mínimamente invasivo para detectar cánceres17,18,19. La alta secuenciación a través del ADN circulante derivado de donantes es fiable para la detección del rechazo después del trasplante deórganos 20,21. Sin embargo, este método requiere una alta concentración y calidad de ADN extraído. Los requisitos de ADN, además del alto costo y el consumo de tiempo, hacen que este método no sea elegible para el uso clínico de rutina. El ADN circulante derivado del donante puede cuantificarse con precisión mediante PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR), que es específico y sensible. Por lo tanto, cuantificar el ADN circulante porcino por qPCR es un método factible para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante. Esto es menos invasivo, altamente sensible y específico, de bajo costo y ahorro de tiempo. Los cerdos y los seres humanos están genéticamente separados con secuencias genómicas muy diferentes(Figura 1). Por lo tanto, el ADN porcino circulante puede ser liberado en la sangre del receptor después del trasplante de xenotrasplante debido al xeno-rechazo. CpsDNA podría ser cuantificado con precisión por qPCR con imprimaciones específicas de la especie en la sangre del receptor. Anteriormente, hemos demostrado la justificación y viabilidad de cpsDNA como biomarcador para el xenotrasplante22,23. Aquí, revelamos consejos y detalles más experimentales. El experimento consta de los pasos siguientes. En primer lugar, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas y se aisló el ADN genómico, que se utilizó para verificar la especificidad de las imprimaciones por PCR regular. En segundo lugar, construir la curva estándar de cpsDNA y aislar cpsDNA a partir de la sangre de la muestra. Por último, el ADN específico del cerdo circulante se cuantificó utilizando qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

La xenotrasplante es un método factible para tratar la insuficiencia orgánica. Sin embargo, cómo controlar eficazmente el rechazo inmune del xenotrasplante es un problema para los médicos e investigadores. Este manuscrito describe un método simple y eficaz para monitorear el rechazo inmune en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El ADN circulante es un biomarcador potencialmente no invasivo para el daño a los órganos. En este estudio, el ADN específico del cerdo circulante (cpsDNA) fue monitoreado durante el rechazo del xenoinjerto por PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR). En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Las imprimaciones específicas de las especies se utilizaron entonces para cuantificar cpsDNA mediante qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El valor de este método sugiere que se puede utilizar como un método simple, conveniente, de bajo costo y menos invasivo para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante.

En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos, y se establecieron curvas estándar para la cuantificación (Figura 4). Las especificidades de las especies de los 19 cebadores fueron confirmadas por la PCR. Las imprimaciones específicas de las especies (primer #4 y primer #11) se utilizaron entonces para cuantificar cpsDNA por qPCR en modelos de trasplante de células de c...

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Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Utilizando imprimaciones específicas de especies, cpsDNA fue cuantificado por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono.

Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

El xenotrasplante es un método factible para tratar Sin embargo, el monitoreo eficaz del rechazo inmune del xenotrasplante es un problema para los médicos y los investigadores. Este protocolo es un método simple, conveniente, de bajo costo y menos invasivo para monitorear el rechazo inmune de la xenotransmutación. Esta técnica se puede utilizar en el campo del xenotrasplante, incluyendo el trasplante de islote de cerdo a humano, trasplante de riñón, trasplante de hígado y trasplante de corazón.Comience por transferir 500 microlitros de muestras de sangre a diferentes tubos de micro centrífuga. Añadir 20 microlitros de proteasa K y 500 microlitros de tampón de lelisis en los tubos. A continuación, agítelos a fondo para mezclar.Poner los tubos en un baño de agua a 56 grados Celsius durante 10 minutos, sacudiéndolos de dos a tres veces durante la incubación hasta que la solución se convierte en centrifugarlos claramente para eliminar las perlas líquidas de la pared interna de las cubiertas del tubo. A continuación, agregue 500 microlitros de alcohol anhidro, alcohol etílico, y agitar bien. Transfiera la mezcla a la columna de adsorción.A continuación, centrifugar la columna durante dos minutos y deseche el líquido de desecho. Agregue 800 microlitros de solución de enjuague a cada columna de adsorción y centrifugar durante un minuto. dejar las columnas a temperatura ambiente durante unos minutos para secar la solución de enjuague restante.Transfiera las columnas de absorción a un tubo centrífugo limpio. Agregue 50 microlitros de tampón de elución a la mitad de las películas de adsorción y colóquelos a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, luego centrifugarlas durante un minuto. Prepare la mezcla maestra de PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego agregue 23 microlitros de la mezcla en cada tubo de micro centrífuga de 0,6 mililitros.Añadir dos microlitros de ADN genómico a cada tubo y cuidadosamente Cabot. A continuación, mezcle brevemente y centrifugar. Coloque los tubos en un ciclor pcR e inicie la amplificación.Cuando la reacción haya terminado, realice la electroforesis de Agarrose. Añadir 1,2 gramos de Agarrose en un matraz que contenga cien milímetros de TAE y hervirlo durante cinco minutos en el microondas. Una vez que la Agaria se haya enfriado a aproximadamente 70 grados Celsius, añadir cinco microlitros de tinte de ácido nucleico en el matraz, lentamente, verter en la placa y dejarlo a temperatura ambiente hasta que se solidifique en un gel.Añadir cinco microlitros de cada muestra y Escalera de ADN de 2 registros o Marcador de ADN 1, en los pozos del gel de Agarosa y electroforesis en 120 millones de muelles hasta que las bandas estén separadas. Visualice el gel con un imágenes ultravioletas. Después de realizar la transformación como se describe en el manuscrito de texto, verifique los plásmidos por digestión enzimática de doble restricción con EcoR I y Bam HI. Separe los productos digeridos con electroforesis de 1%agarosa y exponga el gel a la luz UV.Diluir el plásmido concentrado con el fragmento de ADN porcino a dos veces 10 a la 11a copias por mililitro para la solución estándar de partida, Utilizando agua destilada doble. Para establecer una curva estándar, prepare una mezcla maestra qPCR, como se describe en el manuscrito de texto, y agregue 40 microlitros de la mezcla en cada tubo de una tira de ocho tubos. Añadir 10 microlitros de ADN estándar de diferentes concentraciones, tapar los tubos y luego mezclar brevemente y centrifugarlos.Coloque los tubos en la máquina qPCR y realice la amplificación. Utilice tubos EDTA para recoger muestras de sangre de aproximadamente 400 microlitros de los modelos de parches de arteria de cerdo a mono, o 100 microlitros de los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón. A continuación, transfiera las muestras a tubos centrífugos de 1,5 mililitros.Retire las células sanguíneas de las muestras de sangre por centrifugación a baja temperatura y alta velocidad. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y retire los desechos celulares por centrifugación a 16.000 veces G durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y extraiga el ADN circulante utilizando un suero comercial mientras circula el kit de extracción de ADN.Condensa el volumen de ADN circulante a 40 microlitros y guárdalo en 20 grados Celsius negativos. Realice qPCR para cuantificar el ADN específico del cerdo circulante. Las imprimaciones específicas de porcino fueron diseñadas y utilizadas para cuantificar el ADN específico de cerdo circulante por qPCR, en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y parche de arteria de cerdo a mono, modelos de trasplante.La electroforesis de agarosa se utilizó para aislar fragmentos de ADN amplificados. Utilizando PCR, se identificaron las imprimaciones específicas para el ADN genómico porcino amplificado. A continuación, se confirmaron las especificidades de las especies de estas imprimaciones en la cohorte de ADN genómico humano o mono o en la cohorte de ADN genómico de ratón.Finalmente se utilizaron dos imprimaciones específicas de especies, para amplificar el ADN de cerdo en el parche de la arteria de cerdo a mono y los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón. Lo más importante a recordar al intentar este protocolo, es que se debe prevenir la contaminación de todo tipo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas dentro del xenotrasplante porque es un método simple de bajo costo y no invasivo para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Automatizada de sangre de microfluidos Protocolo de lisis para el Enriquecimiento de la circulación las células nucleadas

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Investigación

Biología

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotrasplante de células madre humanas en el embrión de pollo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...