Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangd segen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fonden för medicinsk disciplinkonstruktion på hög nivå i Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Alla experiment utfördes i enlighet med de relevanta riktlinjer och förordningar av den institutionella granskningsnämnden i Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital i Shenzhen University.
1. Design porcine specifika grund- och primrar
<ol><li>Utför hela genom BLAST analys för att identifiera svin specifika gener som var annorlunda än de hos människor, apor eller mus, med hjälp av programvaran NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).</li>
	<li>Designprimrar enligt 19 grisspec...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Kvantifierande svin cirkulerande DNA representerar en genomförbar metod för att övervaka immun avstötning av xenotransplantation. Gadi et al.24 fann att givarhärledd cirkulerande DNA -halt (ddcfDNA) innehåll i blodet hos patienter med akut avstötning var signifikant högre än för patienter utan avstötning. Dessa studier tyder på att ddcfDNA kan vara en vanlig biomarkör för övervakning av organ moderplantor skador. Under de senaste åren har qPCR alltmer tillämpats på analys av nukl...

Organsvikt är en av de främsta dödsorsakerna1. Transplantation av celler, vävnader och organ är ett effektivt sätt att behandla organsvikt2. Trots detta begränsar bristen på donatororgan den kliniska tillämpningen av denna metod3,4. Studier har visat att svin kan användas som en potentiell källa till mänskliga organ för klinisk transplantation5,6. Men, cross-species organtransplantation ansikten farliga immun avstötning. Därför är det avgörande att övervaka immunavstötningen av xenotransplantation. För närvarande beror klinisk övervakning av immunavstötning främst på patientens tecken och symtom, samt laboratorietester (t.ex. biopsi, immunbiokemisk analys, och ultraljud)7,8,9. Dessa övervakningsmetoder har dock många nackdelar. Tecknen och symtomen på immunavstötning hos patienter visasvanligtvis sent 10, vilket inte är gynnsamt för tidig upptäckt och tidiga insatser; biopsi har nackdelen att vara invasiv11, vilket inte är lätt för patienter att acceptera; immunobiokemisk analys saknar känslighet eller specificitet, och ultraljud är hjälp och dyrt. Därför är det angeläget att hitta en effektiv och bekväm metod för att övervaka immunavstötningen.
Cirkulerande DNA är en extracellulär typ av DNA som finns i blod. Mandel och Metais12 rapporterade först förekomsten av cirkulerande DNA i perifert blod 1948. Under normala fysiologiska förhållanden är cirkulerande DNA i blodet hos friska människor relativt lågt vid baslinjen. Men i vissa patologier, såsom tumörer, hjärtinfarkt, autoimmuna sjukdomar, och transplantation avstötning, kan nivån av cirkulerande DNA i blodet ökasbetydligt 13,14 på grund av den massiva frisättningen av cirkulerande DNA som orsakas av apoptos och nekros. Ursprunget till cirkulerande DNA är associerad med apoptos och nekros15, som är karakteristiska för xenograft avstötning16.
Cirkulerande DNA har visat sig vara en minimalinvasiv biomarkör för att upptäcka cancer17,18,19. Hög genom-sätta sekvensering av givare-härledda cirkulerande DNA är tillförlitlig för detektering av avstötning efter organtransplantation20,21. Denna metod kräver dock en hög koncentration och kvalitet av extraherat DNA. DNA-kraven utöver de höga kostnaderna och tidsåtgången gör denna metod icke valbar för rutinmässig klinisk användning. Donor-derived cirkulerande DNA kan exakt kvantifieras genom kvantitativ realtid PCR (qPCR), som är både specifika och känsliga. Därför är kvantifiera svin cirkulerande DNA genom qPCR en genomförbar metod för att övervaka immun avstötning av xenotransplantation. Detta är mindre invasiv, mycket känslig och specifik, låg kostnad, och tidsbesparande. Grisar och människor är genetiskt åtskilda med helt olika genomiska sekvenser (Figur 1). Därför cirkulerande svin DNA kan släppas ut i mottagarens blod post-xenotransplantation på grund av xeno-avstötning. CpsDNA skulle kunna kvantifieras exakt av qPCR med artspecifika primers i mottagarens blod. Tidigare har vi visat den logiska grunden och genomförbarheten av cpsDNA som en biomarkör för xenotransplantation22,23. Här avslöjar vi mer experimentella tips och detaljer. Experimentet består av följande steg. För det första utformades porcinspecifika primers, och genomiskt DNA isolerades, som användes för att kontrollera specificiteten hos primers av vanlig PCR. För det andra, konstruera standardkurvan för cpsDNA och isolera cpsDNA från provet blodet. Slutligen kvantifierades det cirkulerande grisspecifika DNA med hjälp av qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Xenotransplantation är en genomförbar metod för att behandla organsvikt. Hur man effektivt övervaka immunavstötning av xenotransplantation är dock ett problem för läkare och forskare. Detta manuskript beskriver en enkel och effektiv metod för att övervaka immun avstötning i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa arteriell patch transplantation modeller. Cirkulerande DNA är en potentiellt icke-invasiv biomarkör för organskador. I denna studie, cirkulerande gris-specifika DNA (cpsDNA) övervakades under xenograft avslag av kvantitativa realtid PCR (qPCR). I detta protokoll utformades porcin specifika primers, plasmider-innehållande svin specifika DNA-fragment konstruerades, och standard kurvor för kvantisering fastställdes. Artspecifika primers användes sedan för att kvantifiera cpsDNA av qPCR i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa gatan patch transplantation modeller. Värdet av denna metod tyder på att det kan användas som en enkel, bekväm, låg kostnad, och mindre invasiv metod för att övervaka immun avstötning av xenotransplantation.

I detta protokoll konstruerades porcinspecifika grundfärger, plasmiderinnehållande porcinspecifika DNA-fragment konstruerades, och standardkurvor för kvantisering fastställdes (Figur 4). Artens särdrag av de 19 primersna bekräftades av PCR. Artspecifika primers (primer #4 och primer #11) användes sedan för att kvantifiera cpsDNA av qPCR i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa gatan patch transplantation modeller.
Agaros elektrofores...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

I detta protokoll utformades porcin specifika primers, plasmider-innehållande svin specifika DNA-fragment konstruerades, och standard kurvor för kvantisering fastställdes. Med hjälp av artspecifika primers, var cpsDNA kvantifieras av qPCR i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa artär patch transplantation modeller.

Kvantifiering av cirkulerande Grisspecifikt DNA i blodet hos en Xenotransplantation-modell

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Xenotransplantation är en genomförbar metod för att behandla Men effektiv övervakning av immunavstötning av xenotransplantation är ett problem för läkare och forskare. Detta protokoll är en enkel, bekväm, låg kostnad och mindre invasiv metod för att övervaka immun avstötning av xenotransmutation. Denna teknik kan användas i xenotransplantation fält, inklusive gris-till-människa holme transplantation, njurtransplantation, lever transplantation och hjärta transplantation.Börja med att överföra 500 mikroliter blodprov till olika mikrocentrifugrör. Tillsätt 20 mikroliter av proteas K och 500 mikroliter av lysbuffert i rören. Sedan skaka dem noggrant för att blanda.Sätt rören i ett vattenbad på 56 grader Celsius i 10 minuter, skaka dem två till tre gånger under inkubationen tills lösningen blir klar centrifug dem kort för att ta bort de flytande pärlorna från den inre väggen av rörskydden. Tillsätt sedan 500 mikroliter av vattenfri, etylalkohol, och skaka ordentligt. Överför blandningen i adsorptionskolumnen.Sedan centrifugera kolonnen i två minuter och kasta avfallsvätskan. Lägg till 800 mikroliter av sköljlösning till varje adsorptionskolumn, och centrifug i en minut. låt kolonnerna stå i rumstemperatur i några minuter för att torka den återstående sköljlösningen.Överför absorptionskolumnerna till ett rent centrifugalrör. Lägg till 50 mikroliter elutionsbuffert till mitten av adsorptionsfilmerna och placera dem i rumstemperatur i två till fem minuter, sedan centrifug dem i en minut. Förbered PCR-mastermixen enligt manuskriptriktningar och tillsätt sedan 23 mikroliter av blandningen i varje 0,6 milliliter mikrocentrifugrör.Tillsätt två mikroliter av genomiskt DNA till varje rör och försiktigt Cabot. Blanda sedan kort och centrifug. Placera rören i en PCR-cykelapparat och starta förstärkningen.När reaktionen är klar utföra Agarose elektrofores. Tillsätt 1,2 gram Agaros i en kolv som innehåller hundra millimeter TAE och koka den i fem minuter i mikrovågsugnen. När Agarose har svalnat till cirka 70 grader Celsius, tillsätt fem mikroliter nukleinsyra färgämne i kolven, långsamt, häll den i plattan och lämna den i rumstemperatur tills den stelnar till en gel.Tillsätt fem mikroliter av varje prov och 2-Log DNA Ladder eller DNA-markör 1, i brunnarna i Agarose gel och elektrofores på 120 miljoner pir tills banden separeras. Visualisera gelen med en ultraviolett imager. Efter att ha utfört transformation som beskrivs i textmanuskriptet, verifiera plasmiderna genom dubbel restriktionsenzymspjältsättning med EcoR I och Bam HI. Separera de rötade produkterna med 1%Agarroseelektrofores och utsätt gelen för UV-ljus.Späd den koncentrerade plasmiden med fragmentet av porcin DNA till två gånger 10 till den 11: e kopior per milliliter för startstandardlösningen, Använda dubbelt destillerat vatten. För att upprätta en standardkurva, förbered en qPCR-master mix, som beskrivs i textmanuskriptet och lägg till 40 mikroliter av blandningen i varje rör av en åtta-rörslist. Tillsätt 10 mikroliter av standard-DNA av olika koncentrationer, locket rören sedan kort blanda och centrifug dem.Placera rören i qPCR-maskinen och utför förstärkningen. Använd EDTA-rör för att samla in blodprov på cirka 400 mikroliter från modellerna för djur-till-apa artärplåster, eller 100 mikroliter från modellerna för celltransplantation från gris till mus. Överför sedan proverna till 1,5 milliliter centrifugrör.Avlägsna blodkropparna från blodproven genom centrifugering vid låg temperatur och hög hastighet. Överför supernatanten till ett nytt centrifugrör på 1,5 milliliter och avlägsna cellskräpet genom centrifugering vid 16 000 gånger G i 10 minuter. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 milliliter centrifugrör och extrahera det cirkulerande DNA-na med hjälp av ett kommersiellt serum medan det cirkulerar DNA-extraktionskit.Kondensera volymen av cirkulerande DNA till 40 mikroliter och förvara den vid negativa 20 grader Celsius. Utför qPCR för att kvantifiera det cirkulerande grisspecifika DNA. Svinspecifika primers utformades och användes för att kvantifiera cirkulerande gris-specifika DNA av qPCR, i gris-till-mus cell transplantation modeller och gris-till-apa gatan patch, transplantation modeller.Agarrose elektrofores användes för att isolera amplifierade DNA-fragment. Med hjälp av PCR identifierades de primers-specifika för förstärkt svin genomiska DNA. Därefter bekräftades artspecifika faktorer hos dessa primers i kohorten av apa eller mänskligt genomiskt DNA eller i kohorten av musgenomisk DNA.Slutligen två artspecifika primers, användes för att förstärka gris DNA i gris-till-apa artär patch och gris till mus, cell transplantation modeller. Det viktigaste att komma ihåg när du försöker detta protokoll, är att kontaminering av alla slag bör förhindras. Denna teknik banar väg för forskare att utforska nya frågor inom xenotransplantation eftersom det är en enkel låg kostnad och icke invasiv metod för att övervaka immun avstötning av xenotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Automatiserad Mikroflödessystem Blod Lysis protokoll för anrikning av cirkulerande celler med kärnor

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplantation av mänskliga stamceller i Chicken Embryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisering av DNA-replikering i ryggradsdjur modellsystem DT40 använda tekniken DNA Fiber

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyror: En enkel och snabb DNA-extraktion metod

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...