Name: quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFC1103704), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı (JCYJ20170817172116272), Guang'daki Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar tarafından desteklenmiştir. Dong Eyaleti (2019), Shenzhen Tıp Sanming Projesi (SZSM201412020), Shenzhen Yüksek Düzeyli Tıbbi Disiplin İnşaat Fonu (2016031638), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Tüm deneyler Shenzhen Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Shenzhen İkinci Halk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun ilgili yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Tasarım domuz özel astarlar
<ol><li>NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) yazılımını kullanarak, insanların, maymunların veya farelerden farklı olan domuzlara özgü genleri belirlemek için tüm genom BLAST analizini yapın.</li>
	<li>Primer 5'in yazılımını kullanarak 19 domuza özgü gene<st...

<ol>
	<li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+organ+failure.">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li><li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+donation+after+circulatory+death:+current+status+and+future+potential.">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li><li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs.">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li><li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanting+organs+from+pigs+to+humans.">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).</li><li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+life+for+pig-to-human+transplants.">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li><li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig:+Relevance+to+Xenotransplantation.">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+/CD8(+)+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation.">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).</li><li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation.">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).</li><li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury:+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model.">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li><li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation.">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart &amp; Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li><li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection.">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li><li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+acides+nucl&#233;iques+du+plasma+sanguin+chez+l'homme.">Les acides nucl&#233;iques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li><li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation.">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196 (2011).</li><li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics.">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft.">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138 (2016).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li><li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection.">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation.">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection.">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+&#8212;Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection.">Circulating mi RNA or circulating DNA &#8212;Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).</li><li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection.">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li></ol>

Domuz dolaşan DNA'nın ölçülmesi, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için uygulanabilir bir yaklaşımı temsil eder. Gadi ve ark.24, akut ret olan hastaların kanında donör kaynaklı dolaşım DNA (ddcfDNA) içeriğinin reddedilmeden hastalarınkinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu buldular. Bu çalışmalar ddcfDNA'nın organ grefthasarının izlenmesinde ortak bir biyobelirteç olabileceğini düşündürmektedir. Son yıllarda qPCR, basit çalışması, yüksek otom...

Organ yetmezliği ölüm ana nedenlerinden biridir1. Hücre, doku ve organ nakli organ yetmezliği ni tedavi etmenin etkili bir yoludur2. Bununla birlikte, donör organların sıkıntısı bu yöntemin klinik uygulamasınırlar 3,4. Çalışmalar domuz klinik transplantasyon için insan organlarının potansiyel bir kaynak olarak kullanılabilir göstermiştir5,6. Ancak türler arası organ nakli tehlikeli bağışıklık reddi ile karşı karşıya. Bu nedenle knenotransplantasyonun immün reddini izlemek çok önemlidir. Şu anda, immün ret klinik izleme hastanın belirti ve semptomları, yanı sıra laboratuvar testleri (örneğin, biyopsi, immünobiyokimyasal analiz ve ultrason)7,8,9bağlıdır. Ancak, bu izleme yöntemleribirçok dezavantajları vardır. Hastalarda immün ret belirti ve belirtileri genellikle geç görünür10, erken teşhis ve erken müdahale için elverişli değildir; biyopsi invaziv olma dezavantajı vardır11, hangi hastalar için kabul etmek kolay değildir; immünobiyokimyasal analiz duyarlılık veya özgüllük yoksun, ve ultrason yardımcı ve pahalı. Bu nedenle, bağışıklık reddi izlemek için etkili ve uygun bir yöntem bulmak için acildir.
Dolaşımdaki DNA, kanda bulunan hücre dışı bir DNA türüdür. Mandel ve Metais12 ilk olarak 1948 yılında periferik kanda dolaşan DNA varlığını rapor ettiler. Normal fizyolojik koşullar altında, sağlıklı insanların kanında dolaşan DNA'nın taban çizgisi nispeten düşüktür. Ancak, tümörler, miyokard enfarktüsü, otoimmün hastalıklar ve nakil reddi gibi bazı patolojilerde, kandaki dolaşımdaki DNA düzeyi apopoz ve nekrozun neden olduğu dolaşımdaki DNA'nın büyük salınımı nedeniyle önemli ölçüde artabilir13,14. Dolaşan DNA'nın kökeni apoptoz ve nekroz ile ilişkilidir15, ksenogreft ret özelliği olan16.
Dolaşan DNA kanserleri tespit etmek için minimal-invaziv biyomarker olduğu kanıtlanmıştır17,18,19. Donör kaynaklı sirkülasyon DNA'nın yüksek yoluyla dizilişi organ nakli sonrası ret tespiti için güvenilirdir20,21. Ancak, bu yöntem yüksek konsantrasyon ve çıkarılan DNA kalitesi gerektirir. Yüksek maliyet ve zaman tüketimine ek olarak DNA gereksinimleri bu yöntemi rutin klinik kullanım için uygun hale getirememaktadır. Donör kaynaklı sirkülasyon DNA tam kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), hem özel hem de hassas tarafından ölçülebilir. Bu nedenle, qPCR ile dolaşan domuz eti nin ölçülmesi ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için uygulanabilir bir yöntemdir. Bu daha az invaziv, son derece hassas ve özel, düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlar. Domuzlar ve insanlar genetik olarak oldukça farklı genomik dizilerle ayrılırlar (Şekil 1). Bu nedenle, dolaşan domuz DNA kseno-reddi nedeniyle alıcının kan post-ksenotransplantasyon içine serbest bırakılabilir. CpsDNA, qPCR tarafından alıcının kanında türe özgü astarlarla kesin olarak ölçülebilir. Daha önce, biz kzsiztransplantasyon22,23için bir biyomarker olarak cpsDNA mantığı ve fizibilite göstermiştir. Burada, daha deneysel ipuçları ve ayrıntıları ifşa. Deneme aşağıdaki adımlardan oluşur. İlk olarak, domuz spesifik astarlar tasarlanmış ve genomik DNA izole edildi, hangi normal PCR tarafından astar özgüllüğünü doğrulamak için kullanıldı. İkinci olarak, cpsDNA standart eğrisi inşa ve örnek kan cpsDNA izole. Son olarak, dolaşan domuz özgü DNA qPCR kullanılarak ölçüldü.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ><a>Agarose</a></td>
			<td >Biowest, Barcelona, Spain</td>
			<td >111860</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BamHI-HF</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >R3136S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >MCT-150-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 mL PCR tube</td>
			<td >Axygen&#160;Biosciences, Union City, CA, USA</td>
			<td >PCR-02-C</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6 Mice</td>
			<td >Medical Animal Center of Guangdong Province,&#160; China</td>
			<td ></td>
			<td >8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo&#160;Fisher&#160;Scientific, Walt- ham, MA, USA</td>
			<td >Micro 21R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Log DNA Ladder</td>
			<td >New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA</td>
			<td >N3200S</td>
			<td >0.1&#8211;10.0 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Marker I&#160;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >MD101-02</td>
			<td >0.1&#8211;0.6 kb</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)</td>
			<td >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >DNACOL-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA loading buffer</td>
			<td >Solarbio, Beijing, China</td>
			<td >D1010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II</td>
			<td rowspan="2" >Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA</td>
			<td >D6942</td>
			<td rowspan="2" ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D6943</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EcoR I</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >&#160;1040S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female Bama mini pigs</td>
			<td >BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China</td>
			<td ></td>
			<td >2~4 months</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genomic DNA Extraction Kit &#8544;</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP304-02</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td>
			<td >Toyobo, Osaka, Japan</td>
			<td >QPK-201</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel Doc XR</td>
			<td >Bio-Rad, Hercules, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male cynomolgus monkeys</td>
			<td >Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China</td>
			<td ></td>
			<td >8 years</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid dye(Gelred)</td>
			<td >Biotium, Fremont, USA</td>
			<td >42003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polymerase(Premix Taq)</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >RR901A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pMD19-T plasmid</td>
			<td >Takara&#160;Bio, Shiga, Japan</td>
			<td >D102A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >qPCR machine</td>
			<td >Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Serum/Circulating DNA Extraction Kit</td>
			<td >Tiangen, Beijing, China</td>
			<td >DP339</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TAE</td>
			<td >sangon Biotech, Shanghai, China</td>
			<td >B548101</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circulating pig-specific dna in the blood of a xenotransplantation model

Xenotransplanttransplantorgan yetmezliği tedavisinde uygulanabilir bir yöntemdir. Ancak knenotransplantasyonun immün reddinin nasıl etkin bir şekilde izlenilen bir sorundur. Bu el yazması domuz-fare hücre nakli modelleri ve domuz-to-monkey arter yama transplantasyon modellerinde bağışıklık reddi izlemek için basit ve etkili bir yöntem açıklar. Dolaşımdaki DNA organ hasarı için potansiyel olarak non-invaziv bir biyobelirteçtir. Bu çalışmada, dolaşımdaki domuza özgü DNA (cpsDNA) kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) tarafından ksenogreft reddi sırasında izlendi. Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türlere özgü astarlar daha sonra domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde qPCR ile cpsDNA'yı ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin değeri, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için basit, kullanışlı, düşük maliyetli ve daha az invaziv bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur(Şekil 4). 19 astarın tür özellikleri PCR tarafından doğrulandı. Türlere özgü astarlar (astar #4 ve astar #11) daha sonra domuz-fare hücre nakli modelleri ve domuz-to-maymun arter yama transplantasyon modellerinde qPCR ile cpsDNA ölçmek için kullanıldı.
Agarose elektroforezi yukarıd...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model at JoVE.com

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türe özgü astarlar kullanılarak, domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde cpsDNA qPCR ile ölçüldü.

Knenotransplantasyon Modelinin KanLarında Dolaşan Domuza Özgü DNA'nın Ölçülmesi

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...

Knenotransplantasyon tedavi etmek için uygun bir yöntemdir Ancak, knenotransplantasyonun immün reddinin etkin bir şekilde izlenmesi hekimler ve araştırmacılar için bir sorundur. Bu protokol, ksenotransmümütasyonun immün reddini izlemek için basit, kullanışlı, düşük maliyetli ve daha az invaziv bir yöntemdir. Bu teknik, domuzdan insana adacık nakli, böbrek nakli, karaciğer nakli ve kalp nakli gibi ksenotransplantasyon alanında kullanılabilir.500 mikrolitre kan örneğini farklı mikro santrifüj tüplerine aktararak başlayın. Tüplere 20 mikrolitre proteaz K ve 500 mikrolitre lysis tampon ekleyin. Sonra iyice karıştırmak için sallayın.Tüpleri 10 dakika boyunca 56 derecede bir su banyosuna koyun, kuluçka sırasında 2-3 kez sallayın, çözelti temizlenene kadar tüp kapaklarının iç duvarındaki sıvı boncukları çıkarmak için kısa bir süre için onları santrifüj edin. Sonra Susuz, Etil Alkol 500 mikrolitre ekleyin ve iyice sallayın. Karışımı adsorpsiyon sütununa aktarın.Sonra iki dakika boyunca sütun santrifüj ve atık sıvı atın. Her adsorpsiyon sütununa 800 mikrolitre durulama çözeltisi ekleyin ve bir dakika lığına santrifüj ekleyin. kalan durulama çözeltisini kurutmak için kolonları oda sıcaklığında birkaç dakika bekletin.Emilim kolonlarını temiz bir santrifüj tüpe aktarın. Adsorpsiyon filmlerinin ortasına 50 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve 2-5 dakika oda sıcaklığında yerleştirin, sonra bir dakika santrifüj. PcR ana karışımı nı el yazması yönlere göre hazırlayın, ardından her 0,6 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne 23 mikrolitre karışımı ekleyin.Her tüp ve dikkatle Cabot genomik DNA iki mikrolitre ekleyin. Sonra kısaca karıştırın ve santrifüj. Tüpleri bir PCR döngüsüne yerleştirin ve amplifikasyona başlayın.Reaksiyon bittiğinde Agarose elektroforezgerçekleştirin. Tae yüz milimetre içeren bir şişe içine Agarose 1,2 gram ekleyin ve mikrodalga beş dakika kaynatın. Agarose yaklaşık 70 santigrat dereceye kadar soğuduktan sonra, şişeye beş mikrolitre nükleik asit boyası ekleyin, yavaşça, tabağa dökün ve bir jel haline gelene kadar oda sıcaklığında bırakın.Bantlar ayrılana kadar 120 milyon iskelede Agarose jel ve elektroforez kuyularına her numuneden beş mikrolitre ve 2 Günlük DNA Merdiveni veya DNA Marker 1 ekleyin. Jeli ultraviyole bir görüntüleyiciyle görselleştirin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi dönüşümü gerçekleştirdikten sonra, ecor I ve Bam HI ile çift restriksiyon enzim sindirim iline plazmidleri doğrulayın. Sindirilmiş ürünleri %1 Agarose elektroforezile ayırın ve jeli UV ışığına maruz bırakın.İki kez 10 için başlangıç standart çözüm için mililitre başına 11 kopya domuz DNA parçası ile konsantre plazmid seyreltin, Çift distile su kullanarak. Standart bir eğri oluşturmak için, metin el yazmasında açıklandığı gibi bir qPCR ana karışımı hazırlayın ve sekiz tüplü bir şeridin her tüpüne karışımın 40 mikrolitresini ekleyin. Farklı konsantrasyonlarda standart DNA 10 mikrolitre ekleyin, tüpler kapağı sonra kısa bir süre karıştırın ve onları santrifüj.Tüpleri qPCR makinesine yerleştirin ve amplifikasyon gerçekleştirin. Domuzdan maymuna arter yama modellerinden yaklaşık 400 mikrolitre veya domuzdan fareye hücre nakli modellerinden 100 mikrolitre kan örneği toplamak için EDTA tüpleri kullanın. Daha sonra örnekleri 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.Düşük sıcaklık ve yüksek hızda santrifüj ile kan örneklerinden kan hücrelerini çıkarın. Supernatant'ı 1,5 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre enkazını 16,000 kez G'de 10 dakika santrifüj le çıkarın. Süpernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve DNA çıkarma kitini dolaşırken ticari bir serum kullanarak dolaşan DNA'yı ayıklayın.Sirkülasyondaki DNA hacmini 40 mikrolitreye kadar yoğunlaştırın ve negatif 20 santigrat derecede saklayın. Dolaşan domuza özgü DNA'yı ölçmek için qPCR yapın. Domuza özgü astarlar qPCR ile dolaşan domuza özgü DNA'yı ölçmek için, domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yamalarında, transplantasyon modellerinde tasarlanmış ve kullanılmıştır.Agarose elektroforezi güçlendirilmiş DNA parçalarını izole etmek için kullanıldı. PCR kullanılarak, güçlendirilmiş domuz genomik DNA'sı için astarlar spesifik olarak tanımlandı. Daha sonra, maymun veya insan genomik DNA kohort veya fare genomik DNA kohort bu astarların türlerin özellikleri doğrulandı.Son olarak iki türe özgü astarlar, domuz-to-maymun arter yama domuz DNA yükseltmek için kullanılan ve fare domuz, hücre nakli modelleri. Bu protokol çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, her türlü kontaminasyonun engellenmesi gerektiğidir. Bu teknik, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için basit bir düşük maliyetli ve non invaziv bir yöntem olduğu için araştırmacıların ksenotransplantasyon içinde yeni sorular keşfetmelerinin önünü açtır.

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Çekirdekli Hücreler Sirkülasyon zenginleştirilmesi için Otomatik mikroakışkan Kan Lizis Protokolü

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Tavuk embriyo haline İnsan Kök Hücre Xenotransplantation

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...