Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
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Wir würdigen Dr. Ludovic Richert für seine wertvolle Unterstützung bei der FLIM-Datenerfassung und bei der technischen Wartung und Entwicklung des FLIM-Setups. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/) finanziert. VN wird von der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906) gefördert. YM dankt dem Institut Universitaire de France (IUL) für die Unterstützung und zusätzliche Zeit, um sich der Forschung zu widmen. IJS und JG würdigen das Institut für Arzneimittellieferung in Straßburg für seine finanzielle Unterstützung.

1. Plasmidkonstruktion
<ol><li>Amplify by two PCR (PCR1 and 3) the DNA sequences (use genomic DNA of P. aeruginosa PAO1) of the 700 base pairs up und downstream of the regions corresponding to the insertion site in P. aeruginosa genome with high-fidelity DNA polymerase. Fügen Sie Restriktionssites zu Primern in Blau und Grün hinzu, und fügen Sie eine überlappende Sequenz mit mCherry zu Primern in Rot hinzu (Abbildung 2).<ol>
<li>Für PvdA, das am C-Terminus mit eGFP g...

FLIM-FRET bietet einige wichtige Vorteile gegenüber der intensitätsbasierten FRET-Bildgebung. Die Fluoreszenzlebensdauer ist ein intrinsischer Parameter des Fluorophors. Infolgedessen ist sie weder von lokalen Fluorophorkonzentrationen noch von der Intensität der Lichterregung abhängig. Die Fluoreszenzlebensdauer wird zusätzlich auch durch Photobleichungen schlecht beeinflusst. Besonders interessant ist der Nachweis von PPI in Zellen, in denen die Konzentrationen lokaler Proteine in den subzellulären Kompartimenten...

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) steuern verschiedene Schlüsselprozesse in Zellen1. Die Rollen von PPI unterscheiden sich je nach Proteinzusammensetzung, Affinitätsfunktionen und Positionen in Zellen2. PPI können mit verschiedenen Techniken untersucht werden3. Beispielsweise ist Die Co-Immunpräzipitation ein relativ einfaches, robustes und kostengünstiges, häufig verwendetes Werkzeug zur Identifizierung oder Bestätigung von PPI. Das Studium von PPI kann jedoch eine Herausforderung sein, wenn die interagierenden Proteine einen niedrigen Expressionsgrad aufweisen oder wenn die Wechselwirkungen nur in bestimmten Umgebungen vorübergehend oder relevant sind. Die Untersuchung von PPIs, die zwischen den verschiedenen Enzymen des Pyoverdin-Signalwegs in P. aeruginosa auftreten, erfordert, dass die Unterdrückung des allgemeinen eisenkofaktorierten Repressors Fur entlastet wird, damit die Expression aller Proteine des Pyoverdinwegs in der Zelle4,5,6ausgedrückt werden kann. Diese gemeinsame Regulierung für alle Proteine des Pfades führt zu rechtzeitigen Ausdrücken in der Zelle, von der erwartet wird, dass sie ihre Wechselwirkungen fördert. Die Vielfalt in Umfang, Natur, Expressionsniveaus und die Anzahl der Proteine dieses Stoffwechselwegs erschweren die Untersuchung in rekonstituierten Systemen6. Die Erforschung von PPI in ihrer zellulären Umgebung ist daher entscheidend, um die biologischen Funktionen von Proteinen in ihrem nativen Kontext besser zu verstehen.
Nur wenige Methoden, einschließlich Fluoreszenz, erlauben die Untersuchung von PPI in lebenden Zellen7. Unter den verschiedenen Fluoreszenzparametern, die gemessen werden können, ist die Fluoreszenzlebensdauer (d. h. die durchschnittliche Zeit, in der ein Fluorophor in seinem angeregten Zustand verbleibt, bevor ein Photon emittiert wird) wahrscheinlich einer der interessantesten Parameter, um in lebenden Zellen zu erforschen. Die Fluoreszenzlebensdauer eines Fluorophors ist sehr umweltempfindlich und FLIM kann daher chemische oder physikalische Informationen über die Fluorophorumgebung8liefern. Dazu gehört auch das Vorhandensein von Förster Resonanzenergietransfer (FRET), die in Gegenwart eines "Akzeptors" der Fluoreszenz in kurzer Entfernung eines Fluoreszenz-"Spenders" auftreten kann. Energietransfer führt zu einer signifikanten Verkürzung der Spenderfluoreszenzlebensdauer (Abbildung 1A), was die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) zu einem leistungsstarken Ansatz zur Erforschung von Protein-Protein-Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen macht. FLIM kann zusätzlich räumliche Informationen darüber bereitstellen, wo die Wechselwirkungen in den Zellen7,8stattfinden. Dieser Ansatz ist äußerst leistungsfähig für die Untersuchung von PPI in Situationen, in denen die Kennzeichnung mit Fluorophoren der beiden interagierenden Partner möglich ist.
Damit FRET auftritt - kritische Bedingungen auf dem Abstand zwischen zwei Fluorophoren sinderforderlich 8,9. Die beiden Fluorophore sollten nicht um mehr als 10 nm voneinander entfernt sein. Daher ist bei der Entwicklung von FLIM-FRET-Experimenten Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass der Spender und der Fluoreszenzak eine Chance haben, sich im interagierenden Komplex nahe beieinander zu befinden. Obwohl dies einschränkend erscheinen mag, ist es in der Tat ein echter Vorteil, da die Entfernungsabhängigkeit von FRET sicherstellt, dass zwei markierte Proteine, die SICH FRET unterziehen, physisch interagieren müssen (Abbildung 1A). Die Schwierigkeiten, klare Antworten über PPI in Kolokalisierungsexperimenten zu erhalten (zwei kolokalisierte Proteine können nicht unbedingt interagieren) sind daher kein Problem mit FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Abbildung 1: FLIM-FRET-Analyseprinzip. Jedes Pixel des mehrdimensionalen FLIM-FRET-Bildes enthält Informationen über den fluoreszenzzerfall, der an dieser bestimmten Stelle aufgezeichnet wurde (#counts = Anzahl der erkannten Photonen im Kanal t). (A) Die klassische Darstellung des FLIM-Bildes ist in der Regel ein falschfarbiges, kodiertes 2D-Bild (links). Eine Abnahme der mittleren Fluoreszenzlebensdauer des Spenders - wie durch eine Änderung der Farbskala gesehen - kann in Gegenwart von FRET beobachtet werden und ist informativ über das Vorhandensein von PPI in diesem räumlichen Bereich. (B) Für FRET ist eine Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Gebers und dem Absorptionsspektrum des Gebers erforderlich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Eine zweite Voraussetzung für FRET ist, dass sich das Emissionsspektrum des Spenders und die Absorptionsspektren des Akzeptors überlappen 8 (Abbildung 1B). Die Fluoreszenzerregung des Spenders sollte bei Wellenlängen erfolgen, die sehr wenig zur direkten Fluoreszenzerregung des Akzeptors beitragen. Nicht alle Kombinationen von Fluorophoren sind möglich und wir empfehlen zusätzlich, bevorzugt Spender mit monoexponentiellen Fluoreszenzzerfallen zu verwenden, um FLIM-FRET-Interpretationen zu erleichtern10. Mehrere Paare von Fluoreszenzproteinen erfüllen diese Anforderungen, einschließlich des beliebten eGFP-mCherry-Paares11 (für einen Überblick über die Palette des verfügbaren fluoreszierenden Proteins FRET-Paare siehe12,13).
FLIM-FRET ermöglicht die Messung des Fluoreszenz-Lebensdauerzerfalls eines FRET-Spenders an jedem Pixel eines FLIM-Bildes (Abbildung 1A). Es gibt zwei Haupttechniken zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer, die sich bei der Erfassung und Analyse unterscheiden: Frequency-Domain (FD)14 und Time-Domain (TD). TD FLIM ist weiter verbreitet und wird mit einer gepulsten Beleuchtung in Kombination mit verschiedenen möglichen Detektionskonfigurationen durchgeführt, einschließlich Der Gating-Methoden15, Streifenkamera16 oder zeitkorrelierten Single Photon Counting (TCSPC) Techniken8. Sowohl bei FD- als auch bei TD-Techniken wird die Fluoreszenzlebensdauer nicht direkt gemessen, sondern erfordert eine Analyse der gemessenen Daten, um die Lebensdauer(en) oder das Vorhandensein von Wechselwirkungen zu schätzen. Bei TCSPC-Techniken beruht die am weitesten verbreitete Analyse auf der Anpassung der Zerfälle mit einzelnen oder multiexponentiellen Funktionen unter Verwendung der am wenigsten quadratischen iterativen Revolutionen, die die gewichtete Summe der Residuen minimieren.
Schließlich kann FLIM-FRET sowohl mit einzelnen Photonen- als auch mit Multiphotonen-Erregungen durchgeführt werden. Die neuesten haben mehrere Vorteile wie die Reduzierung von Autofluoreszenz und Photoschaden aus dem Brennflugzeug. Multiphotonen-Erregungen ermöglichen auch eine längere Anregungstiefe, wenn sie in dicken 3D-Probenarbeiten 8. Im Gegenteil, einzelne Photonenanregung ist in der Regel effizienter, da die zwei Photonen Absorption spirationsübergreifende von fluoreszierenden Proteinen begrenzt sind17.
Hier schlagen wir ein Protokoll für FLIM-FRET-Messungen von PPI in Live-P. aeruginosa im speziellen Fall von zwei interagierenden Proteinen (PvdA und PvdL) vor, die mit sehr unterschiedlicher Anzahl von Kopien ausgedrückt werden, um die Qualität und Robustheit der Technik bei der Aufdeckung kritischer Merkmale von PPI zu demonstrieren. PvdA- und PvdL-Proteine sind an der Pyoverdin-Biosynthese beteiligt. PvdA ist eine L-Ornithin-N5-Sauerstoffase und synthetisiert das L-N5-Formyl-N5-Hydroxyornithin aus L-Ornithin durch Hydroxylierung (PvdA) und Formylierung (PvdF)18. PvdL ist ein nicht-ribosomales Peptidsyntheseenzym (NRPS), das aus vier Modulen besteht. Das erste Modul katalysiert die Acylation von Myristinsäure. Das zweite Modul katalysiert die Aktivierung von L-Glu und dessen Kondensation auf das myristische CoA. Dann kondensiert das dritte Modul eine L-Tyr-Aminosäure, die dann in D-Tyr isomerisiert wird. Schließlich bindet das vierte Modul eine L-Dab (Diaminobuttersäure) Aminosäure zu dem acyatierten Tripeptid L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL ist somit für die Synthese der drei ersten Aminosäuren des Pyoverdinvorläufers verantwortlich. Die Interaktion von PvdA-Protein mit PvdL ist überraschend, da PvdL im Gegensatz zu PvdI und PvdJ kein modulspezifisches Modul für das L-N5-Formyl-N5-Hydroxyornithin enthält. Diese Wechselwirkung legt nahe, dass alle Enzyme, die für die Pyoverdin-Vorläufer-Biosynthese verantwortlich sind, in großen transienten und dynamischen multienzymatischen Komplexen angeordnet sind19,20.
In diesem Bericht erklären wir ausführlich, wie man die Bakterienstämme konstruieren kann, die nativ die beiden interagierenden eGFP- und mCherry-markierten Proteine exzieren. Wir beschreiben auch die Probenvorbereitung und die Bedingungen für eine effiziente FLIM-FRET-Zellbildgebung. Schließlich schlagen wir ein Schritt-für-Schritt-Tutorial für die Bildanalyse vor, einschließlich eines kürzlich entwickelten Tools, das erweiterte Visualisierungsmöglichkeiten für die einfache Interpretation komplexer FLIM-FRET-Daten bietet. Mit diesem Bericht möchten wir nicht nur abenteuerlustige, sondern auch die meisten Biologen davon überzeugen, dass FRET-FLIM eine zugängliche und leistungsfähige Technik ist, die in der Lage ist, ihre Fragen zu PPI direkt in der nativen zellulären Umgebung zu beantworten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) steuern verschiedene Schlüsselprozesse in Zellen. Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) in Kombination mit Förster Resonanzenergietransfer (FRET) liefern genaue Informationen über PPI in lebenden Zellen. FLIM-FRET stützt sich auf die Messung des Fluoreszenz-Lebensdauerzerfalls eines FRET-Spenders an jedem Pixel des FLIM-Bildes und liefert quantitative und genaue Informationen über PPI und ihre räumlichen zellulären Organisationen. Wir schlagen hier ein detailliertes Protokoll für FLIM-FRET-Messungen vor, das wir zur Überwachung von PPI in lebenden Pseudomonas aeruginosa im speziellen Fall von zwei interagierenden Proteinen angewendet haben, die mit sehr unterschiedlichen Kopiernummern ausgedrückt werden, um die Qualität und Robustheit der Technik bei der Aufdeckung kritischer Merkmale von PPI zu demonstrieren. Dieses Protokoll beschreibt detailliert alle notwendigen Schritte für die PPI-Charakterisierung - von bakteriellen Mutantenkonstruktionen bis zur Endanalyse mit neu entwickelten Tools, die erweiterte Visualisierungsmöglichkeiten für eine einfache Interpretation komplexer FLIM-FRET-Daten bieten.

Empirische kumulative Verteilungsfunktionen (ecdf) der fluoreszenz-Lebensdauern, die für die verschiedenen Bakterienstämme gemessen wurden, sind in Abbildung 8dargestellt. Tritt FRET auf, werden die Ecdfs in Richtung der kürzeren Lebensdauern verschoben (Abbildung 8A,8B). Beachten Sie, dass, wenn die Wechselwirkung der beiden Proteine zu einem langen Abstand zwischen den beiden Fluorophoren führt, kein FRET auftreten kann (<strong class="xfi...

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FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei stark unterschiedlich exprimierenden Proteinen in lebenden Pseudomonas aeruginosa mit FLIM-FRET-Messungen. Das Protokoll umfasst Bakterienstammkonstruktionen, Bakterienimmobilisierung, Bildgebung und Nach-Imaging-Datenanalyseroutinen.

FLIM-FRET Messungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET ist eine leistungsstarke Technik, die es ermöglicht, vermutete oder vorhergesagte Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bestätigen. In diesem Protokoll stellen wir eine Möglichkeit zur Analyse von Daten in bestimmten Fällen unausgewogener Spender- und Akzeptanzmengen dar. FILM-FRET ist in der Lage, Informationen über die Protein-Protein-Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen zu liefern.Es ist wichtig, persönliche Protein-Wechselwirkungen in der nativen zellulären Umgebung zu untersuchen, insbesondere wenn fluoreszierendes Protein im endogenen Niveau exprimiert wird. Beginnen Sie mit dem Anbau von P.aeruginosa, E.coli TOP10 und E.coli-Helferbakterien in fünf Millilitern LB ohne Antibiotikum bei 30 Grad Celsius, während sie über Nacht zittern. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der Kulturen und mischen Sie eine gleiche Menge p.aeruginosa, E.coli TOP10 und E.coli-Helfer in einem 1,5 Milliliter Mikrotube.Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Minuten bei 9, 300 mal G, um die Bakterien zu pellet, dann entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 50 Mikroliter LB. Einen Punkt der Mischung auf vorgeheizten LB-Agar aufteilen und fünf Stunden bei 37 Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation den Spot mit einer sterilen Impfschleife kratzen und in einem Milliliter LB wieder aufhängen. Platte 100 Mikroliter dieser bakteriellen Suspension auf LB Agar enthält 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 30 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin und inkubieren zwei Tage bei 37 Grad Celsius E.coli TOP10 und E.coli Helfer Bakterien zu beseitigen. Eine Kolonie in einem Milliliter LB wieder aufhängen und bei 37 Grad Celsius mit Orbitalschütteln für vier Stunden bebrüten, dann das Rohr drei Minuten lang bei 9, 300 mal G zentrifugieren und 950 Mikroliter Überstand entsorgen.Setzen Sie das Pellet in 50 Mikroliter LB aus und isolieren Sie das Gemisch auf LB-Agar, der Saccharose und kein Natriumchlorid enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Entdecken Sie isolierte Kolonien auf LB-Agar und LB-Agar mit 15 Milligramm pro Milliliter Gentamycin, um die Gentamycin-Empfindlichkeit zu überprüfen.Legen Sie einen Mikroskopglasschlitten auf eine flache horizontale Oberfläche und ordnen Sie zwei Glasgrutschen mit zwei Schichten Klebeband um sie herum. Pipette ein 70 Mikroliter Tröpfchen von 1%geschmolzenem Agarose auf die Glasrutsche und legen Sie eine vierte Rutsche auf die Oberseite, um den Agarose-Tröpf abzuflachen. Drücken Sie vorsichtig für etwa eine Minute nach unten.Nehmen Sie die obere Rutsche ab und lassen Sie etwa drei Mikroliter Bakterien an drei bis vier Stellen an verschiedenen Stellen auf dem Agarose-Pad fallen. Bedecken Sie das Agarose-Pad mit einem Mikroglas-Coverslip und fixieren Sie es mit geschmolzenem Paraffin, um es ab den vier Ecken auf dem Glasschlitten zu versiegeln. Platzieren Sie die Mikroskopiefolie auf der Bühne mit dem Deckelschlupf zum Objektiv.Drehen Sie den Filterwürfelrevolver, um den eGFP-Würfel auszuwählen, und öffnen Sie den Fluoreszenzlampenverschluss, und senden Sie dann das Fluoreszenzlicht in Richtung des Okulars des Mikroskops. Konzentrieren Sie das Ziel mit dem Mikroskopknopf auf die Bakterien. Wählen Sie einen Bereich aus, der für die Probe von Interesse ist, indem Sie den Joystick verwenden, der die motorisierte Phase steuert.Senden Sie den Fluoreszenz-Emissionspfad zurück zum Detektor, drehen Sie dann den Filterwürfelturm zurück, um den dichroitischen Würfel für den 930-Nanometer-Laser auszuwählen, und stellen Sie die Laserleistung auf 20 Milliwatt ein. Stellen Sie die Größe des Interessenbereichs auf 30 Mikrometer ein, wodurch die Spannung, die die Galvospiegel bedient, eingestellt wird und der Bereich ihrer Bewegungen definiert wird. Schalten Sie den Detektor ein und starten Sie das Scannen der Probe.Wählen Sie das Sichtfeld für die Bildgebung aus, indem Sie die Bühne fein von der Computeroberfläche aus verschieben. Dies kann auf dem Setup durch Verschieben des Kreuzes auf dem Bild in der Mikroskop-Steuerungssoftware, die die neue Mitte des Bildes und Drücken Bewegungsstufe definieren. Ein gutes Sichtfeld für den Erwerb sollte 10 bis 30 unbewegliche Bakterien enthalten.Wenn Sie an der Extraktion von Einzelzellen FILM-FRET-Daten interessiert sind, stellen Sie sicher, dass die Bakterien gut individualisiert sind. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und überprüfen Sie, ob die Photonenanzahl nicht zu hoch ist, um einen Anhäufungseffekt zu vermeiden, der Die Lebensdauermessungen beeinflussen kann. Senken Sie bei Bedarf die Laserintensität, um die Photonenanzahl niedrig zu halten.Passen Sie Erfassungsparameter einschließlich der Erfassungserfassungszeit an. Drücken Sie die Starttaste und warten Sie, bis die Erfassung abgeschlossen ist. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie RStudio, und erstellen Sie ein neues Projekt.Erstellen Sie einen neuen Ordner im Hauptprojektordner, und benennen Sie ihn als Daten, und verschieben Sie dann alle Analysefragendateien in diesen Ordner. Öffnen Sie eine neue Skriptdatei oder das zusätzliche Skript flim_analysis.r. Installieren Sie das spezielle FlimDiagRam-Paket für die Filmdatenanalyse und rufen Sie das Paket im Arbeitsbereich auf.Empirische kumulative Verteilungsfunktionen der fluoreszenz-Lebensdauern, die für die verschiedenen Bakterienstämme gemessen werden, werden hier gezeigt. Wenn FRET auftritt, werden die Funktionen in die kürzere Lebensdauer verschoben. Es ist wichtig zu beachten, dass FRET nicht auftreten kann, wenn die Interaktion der beiden Proteine zu einem langen Abstand zwischen den beiden Flurophoren führt, der nicht von der Abwesenheit von Interaktion unterschieden werden kann.Daher kann es notwendig sein, die Proteine an verschiedenen Positionen zu kennzeichnen, um die Chancen zu maximieren, die Wechselwirkung zu prüfen. Aufgrund des großen Unterschieds in den Proteinausdrücken zwischen PvdA und PvdL führt derselbe Komplex nicht zu ähnlichen FILM-FRET-Daten. Unausgewogene Stoichiometrien führen zu Unterschieden im Beitrag der freien im Vergleich zu den gebundenen spendermarkierten Proteinen in der aufgezeichneten Fluoreszenz-Lebensdauerverteilung.Das Diagrammdiagramm kann verwendet werden, um wichtige Informationen über die Stoichiometrie bereitzustellen. In der PvdA-eGFP mCherry-PvdL-Mutation ist die Menge an PvdA mit Spenderkennzeichnung viel höher als die Menge an mCherry-PvdL. Von allen Spendern, die in der Stichprobe anwesend sind, interagieren nur wenige von ihnen mit PvdL.Der einzelne Tau-Eins-Wert, der auf ca. 2,3 Nanosekunden zentriert ist, legt nahe, dass jeder PvdA-eGFP-Spender nur mit einem mCherry-PvdL-Akzeptor übertragen kann. Wenn die Kennzeichnung umgekehrt ist, wird erwartet, dass die meisten eGFP-PvdL-Proteine mit PvdA-mCherry interagieren, was durch die höheren Alpha-Ein-Werte bestätigt wird. Die Tau-Ein-Werte wurden stärker verteilt, was darauf hindeutet, dass mehrere PvdA-Proteine an ein einzelnes PvdL-Protein binden können.Das FLIM-Setup wird in immer mehr Bildverarbeitungseinrichtungen verfügbar. Die Bildgebung von Proben in einem FILM-FRET ist nicht komplizierter als die Bildgebung in der Videomikroskopie.

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

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Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Forschung

Biologie

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

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Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

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Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

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Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...