Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
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Reconocemos al Dr. Ludovic Richert por su valiosa asistencia en la adquisición de datos FLIM y por el mantenimiento técnico y desarrollo de la configuración de FLIM. Esta obra fue financiada por subvenciones de la Fundación para la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN está financiado por la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). YM agradece al Institut Universitaire de France (IUF) por su apoyo y por su tiempo adicional para dedicarse a la investigación. IJS y JG reconocen al Instituto de Entrega de Drogas de Estrasburgo por su apoyo financiero.

1. Construcción de Plásmido
<ol><li>Amplificar por dos PCR (PCR1 y 3) las secuencias de ADN (utilizar ADN genómico de P. aeruginosa PAO1) de los 700 pares base aguas arriba y aguas abajo de las regiones correspondientes al sitio de inserción en el genoma de P. aeruginosa con polimerasa de ADN de alta fidelidad. Agregue sitios de restricción a los imprimadores en azul y verde y agregue una secuencia superpuesta con mCherry a los imprimadores en rojo (Figura 2).<ol>
<l...

FLIM-FRET ofrece algunas ventajas clave sobre las imágenes FRET basadas en la intensidad. La vida útil de la fluorescencia es un parámetro intrínseco del fluoróforo. Como consecuencia, no depende de las concentraciones locales de fluoróforos ni de la intensidad de la excitación de la luz. La vida útil de la fluorescencia también se ve mal afectada por el foto-blanqueo. Es particularmente interesante evidenciar IBP en células donde las concentraciones de proteínas locales pueden ser altamente heterogéneas en t...

Las interacciones proteína-proteína (IPP) controlan varios procesos clave en las células1. Las funciones de los IBP difieren en función de la composición de proteínas, las funciones de afinidades y las ubicaciones en las células2. Los IBP se pueden investigar a través de diferentes técnicas3. Por ejemplo, la co-inmunoprecipitación es una herramienta relativamente simple, robusta y económica de uso común para identificar o confirmar los IBP. Sin embargo, estudiar los IBP puede ser difícil cuando las proteínas que interactúan tienen niveles de expresión bajos o cuando las interacciones son transitorias o relevantes solo en entornos específicos. El estudio de los IBP que se produce entre las diferentes enzimas de la vía de la pyoverdina en P. aeruginosa requiere que la represión del represor general cofactorado del hierro Fur se libere para permitir que la expresión de todas las proteínas de la vía pyoverdina se exprese en la célula4,5,6. Esta regulación común para todas las proteínas de la vía resulta en expresiones oportunas en la célula que se espera que promuevan sus interacciones. La diversidad en términos de tamaño, naturaleza, niveles de expresión y el número de proteínas de esta vía metabólica dificultan el estudio en sistemas reconstituidos6. Por lo tanto, explorar los IBP en su entorno celular es fundamental para comprender mejor las funciones biológicas de las proteínas en su contexto nativo.
Sólo unos pocos métodos, incluyendo la fluorescencia, permiten explorar los IBP en las células vivas7. Entre los diferentes parámetros de fluorescencia que se pueden medir, la vida útil de la fluorescencia (es decir, el tiempo promedio que un fluoróforo permanece en su estado excitado antes de emitir un fotón) es probablemente uno de los parámetros más interesantes para explorar en las células vivas. La vida útil de la fluorescencia de un fluoróforo es altamente sensible a su entorno y, por lo tanto, FLIM puede proporcionar información química o física sobre el entorno del fluoróforo8. Esto incluye la presencia de la transferencia de energía por resonancia de la resonancia (FRET) que puede ocurrir en presencia de un "aceptador" de fluorescencia situado a una corta distancia de un "donante" de fluorescencia. La transferencia de energía da como resultado un acortamiento significativo de la vida útil de la fluorescencia del donante(Figura 1A),haciendo de la Microscopía de Imagen de Por Vida de Fluorescencia (FLIM) un enfoque poderoso para explorar las interacciones proteína-proteína directamente en las células vivas. FLIM también puede proporcionar información espacial sobre dónde tienen lugar las interacciones en las celdas7,8. Este enfoque es extremadamente eficaz para investigar los IBP en situaciones en las que es posible etiquetar con fluoróforos de los dos socios que interactúan.
Para que se produzca FRET - se requieren condiciones críticas en la distancia entre dos fluoróforos8,9. Los dos fluoróforos no deben estar distantes entre sí por más de 10 nm. Por lo tanto, se deben tomar precauciones al diseñar experimentos FLIM-FRET para asegurar que el donante y el aceptador de la fluorescencia tengan la oportunidad de ubicarse cerca uno del otro en el complejo que interactúa. Si bien esto puede parecer restricnte, de hecho es una verdadera ventaja, ya que la dependencia a distancia de FRET garantiza que dos proteínas etiquetadas sometidas a FRET tienen que interactuar físicamente (Figura 1A). Por lo tanto, las dificultades para obtener respuestas claras sobre el IBP en experimentos de colocación (dos proteínas colocadas pueden no interactuar necesariamente) no son un problema al usar FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Figura 1: Principio de análisis FLIM-FRET. Cada píxel de la imagen multidimensional FLIM-FRET contiene información sobre la descomposición de la fluorescencia registrada en esta ubicación en particular (#counts número de fotones detectados en el canal t). (A) La representación clásica de la imagen FLIM suele ser una imagen 2D codificada de duración de color falso (izquierda). Una disminución en la vida media de fluorescencia del donante - como se ve por un cambio en la escala de color - se puede observar en presencia de FRET y es informativo sobre la presencia de IBP en esta área espacial. (B) La superposición entre el espectro de emisión del donante y el espectro de absorción del aceptador es necesaria para que se produzca el FRET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Un segundo requisito para el FRET es que el espectro de emisión del donante y los espectros de absorción del aceptador se superpongana 8 (Figura 1B). La excitación fluorescencia del donante debe estar en longitudes de onda que contribuyan muy poco a la excitación directa de fluorescencia del aceptador. No todas las combinaciones de fluoróforos son posibles y además recomendamos utilizar preferentemente donantes con decaimientos monoexponenciales de fluorescencia para facilitar las interpretaciones FLIM-FRET10. Varias parejas de proteínas de fluorescencia cumplen con estos requisitos, incluyendo la popular pareja eGFP-mCherry11 (para una revisión sobre la paleta de pares de proteínas fluorescentes disponibles FRET ver12,13).
FLIM-FRET permite medir la descomposición de por vida de la fluorescencia de un donante FRET en cada píxel de una imagen FLIM (Figura 1A). Hay dos técnicas principales para determinar la vida útil de la fluorescencia que difieren en la adquisición y el análisis: dominio de frecuencia (FD)14 y dominio de tiempo (TD). TD FLIM es más extendido y se realiza utilizando una iluminación pulsada combinada con diferentes configuraciones de detección posibles, incluidos los métodos de medición15,la cámara de rayas16 o las técnicas de recuento de fotones individuales (TCSPC) correlacionadas en el tiempo8. Para las técnicas de DF y TD, la vida útil de la fluorescencia no se mide directamente, pero requiere un análisis de los datos medidos para estimar la duración o la presencia de interacciones. Para las técnicas TCSPC, el análisis más utilizado se basa en el ajuste de los decaimientos con funciones exponenciales únicas o múltiples utilizando re-convoluciones iterativas menos cuadradas que minimizan la suma ponderada de los residuos.
Por último, FLIM-FRET se puede realizar mediante excitaciones de un solo fotón o multifotón. Los últimos tienen varias ventajas como reducir la autofluorescencia y fotodago fuera del plano focal. Las excitaciones multifotofoto permiten también una profundidad de excitación más larga si se trabaja en muestras 3D gruesas8. Por el contrario, la excitación de un solo fotón suele ser más eficiente, ya que las secciones transversales de absorción de dos fotones de las proteínas fluorescentes están limitadas17.
Aquí, proponemos un protocolo para las mediciones FLIM-FRET de los IBP en vivo P. aeruginosa en el caso particular de dos proteínas que interactúan (PvdA y PvdL) expresadas con un número muy diferente de copias para demostrar la calidad y robustez de la técnica para revelar características críticas de los IBP. Las proteínas PvdA y PvdL están implicadas en la biosíntesis de la pioverdina. PvdA es una L-ornitina N5-oxigenasa y sintetiza la L-N5-formyl-N5-hidroxiornitina de L-ornitina por hidroxilación (PvdA) y formilación (PvdF)18. PvdL es una enzima de síntesis de péptidos no ribosomales (NRPS) compuesta por cuatro módulos. El primer módulo cataliza la acilación del ácido mirístico. El segundo módulo cataliza la activación de L-Glu y su condensación al mirístico-coA. Entonces, el tercer módulo condensa un aminoácido L-Tyr que luego se isomeriza en D-Tyr. Finalmente, el cuarto módulo une un aminoácido L-Dab (ácido diaminobutírico) para formar el tripéptido acilado L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL es así responsable de la síntesis de los tres primeros aminoácidos del precursor de la pyoverdina. La interacción de la proteína PvdA con PvdL es sorprendente ya que PvdL, al contrario de PvdI y PvdJ, no lleva un módulo específico para la L-N5-formyl-N5-hidroxiornitina. Esta interacción sugiere que todas las enzimas responsables de la biosíntesis precursora de la pyoverdina están dispuestas en grandes complejos multienzimáticos transitorios y dinámicos19,20.
En este informe explicamos en detalle cómo construir las cepas bacterianas expresando de forma nativa las dos proteínas eGFP y mCherry etiquetadas de forma nativa. También describimos la preparación de muestras y las condiciones para obtener imágenes celulares FLIM-FRET eficientes. Por último, proponemos un tutorial paso a paso para el análisis de imágenes que incluye una herramienta desarrollada recientemente que ofrece posibilidades de visualización avanzadas para la interpretación directa de datos complejos de FLIM-FRET. Con este informe, nos gustaría convencer no sólo a los aventureros, sino a la mayoría de los biólogos de que FRET-FLIM es una técnica accesible y poderosa capaz de abordar sus preguntas sobre los IBP directamente en el entorno celular nativo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

Las interacciones proteína-proteína (IPP) controlan varios procesos clave en las células. La microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) combinada con la transferencia de energía por resonancia de F.R. (FRET) proporciona información precisa sobre los IBP en células vivas. FLIM-FRET se basa en la medición de la descomposición de por vida de la fluorescencia de un donante FRET en cada píxel de la imagen FLIM, proporcionando información cuantitativa y precisa sobre los IBP y sus organizaciones celulares espaciales. Proponemos aquí un protocolo detallado para las mediciones FLIM-FRET que aplicamos para monitorear los IBP en Pseudomonas aeruginosa en vivo en el caso particular de dos proteínas que interactúan expresadas con números de copia muy diferentes para demostrar la calidad y robustez de la técnica para revelar características críticas de los IBP. Este protocolo describe en detalle todos los pasos necesarios para la caracterización de PPI, desde construcciones mutantes bacterianas hasta el análisis final utilizando herramientas desarrolladas recientemente que proporcionan posibilidades de visualización avanzadas para una interpretación directa de datos complejos de FLIM-FRET.

Las funciones de distribución acumulativa empírica (ecdf) de la vida útil de la fluorescencia medidas para las diferentes cepas bacterianas se muestran en la Figura 8. Si se produce FRET, los ecdfs se desplazan hacia la vida útil más corta(Figura 8A,8B). Tenga en cuenta que cuando la interacción de las dos proteínas da como resultado una larga distancia entre los dos fluoróforos, no puede ocurrir fret (Figura 8C</str...

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FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Aquí describimos un protocolo para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas muy diferentes en Pseudomonas aeruginosa viva utilizando mediciones FLIM-FRET. El protocolo incluye construcciones de cepas de bacterias, inmovilización de bacterias, imágenes y rutinas de análisis de datos post-imágenes.

FLIM-FRET Mediciones de interacciones proteína-proteína en bacterias vivas.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET es una potente técnica que permite confirmar sospechas o predichas interacciones proteína-proteína. En este protocolo, presentamos una forma de analizar datos en casos particulares de cantidades de donantes y aceptantes desequilibradas. FILM-FRET es capaz de proporcionar información sobre las interacciones proteína-proteína directamente en células vivas.Es importante investigar las interacciones personales-proteínas en el entorno celular nativo, en particular cuando la proteína fluorescente se expresa en el nivel endógeno. Comience por el crecimiento de P.aeruginosa, E.coli TOP10, y E.coli bacterias auxiliares cada uno en cinco mililitros de LB sin antibióticos a 30 grados Celsius mientras se agita durante la noche. Al día siguiente, mida la densidad óptica de los cultivos y mezcle una cantidad igual de P.aeruginosa, E.coli TOP10 y E.coli ayudante en un microtubo de 1,5 mililitros.Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 9,300 veces G para peletizar las bacterias, luego desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 microlitros de LB. Pída una mancha de la mezcla en el agar LB precalentado y incuba durante cinco horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, raspar el punto con un lazo de inoculación estéril y resuspenderlo en un mililitro de LB. Placa 100 microlitros de esta suspensión bacteriana en agar LB que contiene 10 microgramos por mililitrolitor cloramphenicol y 30 microgramos por mililitro gentamicina e incubar dos días a 37 grados Celsius para eliminar las bacterias auxiliares E.coli TOP10 y E.coli. Resuspender una colonia en un mililitro de LB e incubarlo a 37 grados Celsius con temblor orbital durante cuatro horas, luego centrifugar el tubo durante tres minutos a 9.300 veces G y desechar 950 microlitros de sobrenadante.Resuspender el pellet en 50 microlitros de LB y aislar la mezcla en agar LB que contiene sacarosa y sin cloruro de sodio. Incubar la placa durante la noche a 30 grados centígrados. Detectar colonias aisladas en el agar LB y el agar LB que contiene 15 miligramos por mililitro gentamicina con el fin de comprobar la sensibilidad a la gentamicina.Coloque un portaobjetos de vidrio de microscopio sobre una superficie horizontal plana y coloque dos diapositivas de vidrio rematadas con dos capas de cinta adhesiva a su alrededor. Pipetear una gota de 70 microlitros de 1% de agarosa fundida en el tobogán de vidrio y colocar una cuarta diapositiva en la parte superior para aplanar la gota de agarosa. Presione suavemente durante aproximadamente un minuto.Quítese el portaobjetos superior y deje caer alrededor de tres microlitros de bacterias en tres a cuatro puntos en diferentes lugares de la almohadilla de agarosa. Cubra la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos de vidrio de microscopía y fíjela con parafina fundida para sellándola en el portaobjetos de vidrio comenzando con las cuatro esquinas. Coloque la diapositiva de la microscopía en el escenario con el cubreobjetos mirando hacia el objetivo.Gire la torreta del cubo del filtro para seleccionar el cubo eGFP y abra el obturador de la lámpara de fluorescencia, luego envíe la luz de fluorescencia hacia el ocular del microscopio. Enfoque el objetivo en las bacterias utilizando la perilla del microscopio. Seleccione una región de interés en la muestra utilizando el joystick que controla la etapa motorizada.Envíe la ruta de emisión de fluorescencia hacia el detector, luego gire la torreta del cubo del filtro para seleccionar el cubo dicroico para el láser de 930 nanómetros y establezca la potencia del láser en 20 milivatios. Establezca el tamaño de la región de interés en 30 micrómetros que ajuste la tensión que opera los espejos galvo y define el rango de sus movimientos. Encienda el detector y comience a escanear la muestra.Elija el campo de visión de la imagen moviendo con firmez el escenario desde la interfaz del ordenador. Esto se puede hacer en la configuración moviendo la cruz en la imagen en el software de control del microscopio que definirá el nuevo centro de la imagen y presionando la etapa de movimiento. Un buen campo de visión para la adquisición debe contener de 10 a 30 bacterias inmóviles, todas enfocadas.Si está interesado en extraer datos film-FRET de células individuales, asegúrese de que las bacterias estén bien individualizadas. Abra el software de imágenes y compruebe que la tasa de recuento de fotones no es demasiado alta para evitar un efecto de acumulación que puede influir en las mediciones de por vida. Si es necesario, reduzca la intensidad del láser para mantener la tasa de recuento de fotones baja.Ajuste los parámetros de adquisición, incluido el tiempo de recogida de la adquisición. Pulse el botón de inicio y espere a que finalice la adquisición. Para analizar los datos, abra RStudio y cree un nuevo proyecto.Cree una nueva carpeta en la carpeta principal del proyecto y asígnele el nombre data y, a continuación, mueva todos los archivos de solicitud de análisis a esta carpeta. Abra un nuevo archivo de script o el script complementario flim_analysis.r. Instale el paquete FlimDiagRam dedicado para el análisis de datos de película y llame al paquete en el área de trabajo.Aquí se muestran las funciones de distribución acumulativa empírica de la vida útil de la fluorescencia medida para las diferentes cepas bacterianas. Si se produce FRET, las funciones se desplazan hacia las vidas más cortas. Es importante tener en cuenta que el FRET no puede ocurrir cuando la interacción de las dos proteínas resulta en una larga distancia entre los dos fluróforos, que no se pueden distinguir de la ausencia de interacción.Por lo tanto, puede ser necesario etiquetar las proteínas en diferentes posiciones para maximizar las posibilidades de sondear la interacción. Debido a la gran diferencia en las expresiones proteicas entre PvdA y PvdL, el mismo complejo no da lugar a datos FILM-FRET similares. Las estequiometrías desequilibradas conducen a diferencias en la contribución de los libres en comparación con las proteínas etiquetadas por donantes en la distribución de por vida de fluorescencia registrada.La gráfica de diagrama se puede utilizar para proporcionar información crítica sobre la estequiometría. En el mutante PvdA-eGFP mCherry-PvdL, la cantidad de PvdA con etiqueta de donante es mucho mayor que la cantidad de mCherry-PvdL. Entre todos los donantes presentes en la muestra, sólo unos pocos de ellos están interactuando con PvdL.El único valor tau centrado en aproximadamente 2,3 nanosegundos sugiere que cada donante PvdA-eGFP solo puede transferirse con un aceptador mCherry-PvdL. Cuando se invierte el etiquetado, se espera que la mayoría de las proteínas eGFP-PvdL interactúen con PvdA-mCherry, lo que se confirma por los valores alfa uno más altos. Los valores tau uno se volvieron más distribuidos, lo que sugiere que múltiples proteínas JcdA pueden unirse a una sola proteína JcdL.La configuración de FLIM está disponible en un número cada vez mayor de instalaciones de imágenes. Las muestras de imágenes en un FILM-FRET no son más complicadas que las imágenes en microscopía de vídeo.

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

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Investigación

Biología

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El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

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