Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الهيكلي للاتحاد الأوروبي (ESF/14-BM-A55-0024/18). بالإضافة إلى ذلك، يتم دعم H.L. من قبل برنامج FORUN من المركز الطبي لجامعة روستوك (889001 و 889003) ومؤسسة جوزيف وكاثي كلينز (T319/29737/2017). ويدعم C.I.L. من قبل برنامج العلماء السريرية للمركز الطبي جامعة روستوك. ويدعم R.D من قبل DFG (DA1296/6-1)، ومؤسسة دامب، ومؤسسة القلب الألمانية (F/01/12) وBMBF (VIP+ 00240).
نشكر مادلين بارتش على دعمها الفني في ثقافة خلايا iPSC وتمايز القلب.

وقد تم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول التي تشمل فئران حديثي الولادة والبالغين وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لرعاية الحيوانات من المركز الطبي جامعة روستوك.
1. زراعة وتفكك من iPSC المشتقة من القلب
<ol><li>تمييز hiPSC-CMs لمدة 25 يوما باستخدام أسلوب أحادية 2D كما هو موض?...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

إن توليد CM المشتق من iPSC الوظيفي في المختبر مهم للعلاجات التجديدية ، والنمذجة المرض وتطوير منصات فحص المخدرات. ومع ذلك، النضج غير الكافي لهذه CM عقبة رئيسية في أبحاث القلب والأوعية الدموية20. وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى تقنيات تصوير عالية الدقة تمكن من رصد حالة النضج الهيكلي لـ ...

أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) مثل احتشاء عضلة القلب أو اعتلال عضلة القلب لا تزال السبب الرئيسي للوفاة في العالم الغربي1. وبما أن قلب الإنسان لا يملك سوى ضعف القدرة التجديدية، هناك حاجة إلى استراتيجيات لتعزيز التعافي من الأمراض القلبية الوعائية. وهذا يشمل العلاجات استبدال الخلايا لتجديد خلايا القلب المفقودة (CM)، فضلا عن تطوير أدوية جديدة لمكافحة عدم انتظام النشاط التدخل الدوائي آمنة وفعالة. وقد تبين أن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) مصدر خلية واعدة للجيل غير محدود من CM الإنسان في المختبر، ومناسبة للعلاجات التجديدية، ونمذجة المرض، وتطوير فحص المخدرات المقايسات2،3،4.
على الرغم من وجود العديد من بروتوكولات تمايز القلب المختلفة ، لا يزال يوجد CM مشتق من iPSC بعض الجوانب الظاهرية والوظيفية التي تعوق المختبر وفي تطبيق vivo5،6. بجانب التغيرات الكهربية ، الأيضية ، والجزيئية ، تتضمن عملية نضوج القلب التنظيم الهيكلي للساركوميريات ، وهي الوحدات الأساسية المطلوبة لتوليد القوة وانكماش الخلايا7. في حين أن كبار CMs المعرض جهاز التعاقد منظمة تنظيما جيدا، وCMs المشتقة من iPSC عادة ما تظهر خيوط ساركومير غير مرتبة، المرتبطة انخفاض القدرة على الانكماش وتغيير ديناميات الانكماش8،9. على النقيض من درجة الحرارة الناضجة التي تظهر نمط انكماش uniaxial ، والهياكل مشوشة في نتائج CM غير ناضجة في تقلص شعاعي للخلية بأكملها أو تعزيز ظهور نقاط التركيز انكماش9،10.
لتحسين نضوج القلب، وقد تم تطبيق نهج متعددة، بما في ذلك 3D وسائل زراعة الخلايا، والتحفيز الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن استخدام مصفوفات خارج الخلية محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12،13. لتقييم نجاح وكفاءة هذه الظروف الثقافية المختلفة ، هناك حاجة إلى تقنيات لرصد وتقدير درجة النضج الهيكلي لـ iPSC CM ، على سبيل المثال ، عن طريق التقنيات المجهرية. على النقيض من التصوير confocal التقليدية، دقة في حالة المجهر تعريب مبطل ضوئي (بالم) هو ما يقرب من 10x أعلى. هذه التقنية بدورها تسمح لتحليل أكثر دقة، والكشف عن التعديلات حتى خفية من الهياكل الخلوية14. وبالنظر إلى الدقة العالية للتصوير القائم على النخلة، كان الهدف العام من هذه الطريقة هو التقييم المجهري لنضج الساروميري في CMS المشتقة من iPSC عن طريق التحديد الدقيق لسمك القرص z وطول الساركومير. في الدراسات السابقة، وقد تبين أن هذه السمات الهيكلية لتكون المعلمات المناسبة لتقييم نضج القلب15. على سبيل المثال، المرضى iPSC-CM تفتقر كامل طول ديستروفين معرض انخفاض طول الساركومير وعرض z-الفرقة بالمقارنة مع خلايا نوع البرية16. وبالمثل، تم قياس طول الساركوميريات الفردية للتحقيق في تأثير الإشارات الطبوغرافية على تطوير القلب16. ومن ثم، قمنا بتطبيق هذا النهج لتقييم النضج الهيكلي لشبكة ساركومير في iPSC-CM عن طريق قياس كمية طول الساركومير وسمك القرص z.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

نضوج القلب المشتق من iPSC هو قضية حاسمة لتطبيقها في العلاج التجديدي واختبار الأدوية وطراز الأمراض. على الرغم من تطوير بروتوكولات التمايز المتعددة ، فإن توليد عضلة القلب iPSC تشبه النمط الظاهري الشبيه بالراشد لا يزال صعبًا. أحد الجوانب الرئيسية لنضوج القلب و القلب ينطوي على تشكيل شبكة ساركومير منظمة تنظيما جيدا لضمان قدرة انكماش عالية. هنا، نقدم نهج فائقة القرار القائم على التحليل شبه الكمي لشبكة α actinin في cardiomyocytes. باستخدام المجهر التعريب photoactivated مقارنة طول السارومير وسمك القرص z من خلايا القلب المشتقة من iPSC والخلايا القلبية المعزولة عن أنسجة حديثي الولادة تم تنفيذها. في الوقت نفسه، نبرهن على أهمية ظروف التصوير المناسبة للحصول على بيانات موثوقة. تظهر نتائجنا أن هذه الطريقة مناسبة لمراقبة كمية النضج الهيكلي للخلايا القلبية ذات الدقة المكانية العالية ، مما يتيح الكشف عن التغيرات الدقيقة في تنظيم الساركومير.

لتقدير درجة النضج الهيكلي ل CM، حديثي الولادة، بالغ ناضجة تماما، و iPSC CM وصفت في البداية CM مع الأجسام المضادة α actinin لتصور شبكة ساركومير. بعد الاستحواذ على PALM ، تم إعادة بناء الصور ، وتم قياس سمك القرص z باستخدام برنامج معالجة الصور المستند إلى البرنامج الإضافي للكشف التلقائي عن عرض خيوط فردي?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

تشكيل شبكة ساركومير المناسبة مهم لنضوج القلب المشتق من iPSC. نقدم نهجًا فائقًا قائمًا على القرار يسمح بالتقييم الكمي للنضج الهيكلي للخلايا الجذعية المشتقة من خلايا القلب، لتحسين ظروف الثقافة التي تعزز تطور القلب.

تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

يمكن استخدام هذه الطريقة للتقييم الكمي لنضوج الساركومير في عضلة القلب المشتقة من iPSC. باستخدام هذا النهج القائم على القرار الفائق ، من الممكن الكشف عن حتى تغييرات خفية في منظمة الساروميري ، وهو أمر غير ممكن مع التصوير confocal التقليدية. قبل الاستخدام بثلاث ساعات على الأقل، قم بتشغيل المجهر وجلب العينة إلى درجة حرارة الغرفة.عندما يكون المجهر جاهزًا، أضف 300 ميكرولترات من مخزن تصوير PALM إلى بئر من الخلايا المسماة وأدخل الشريحة في الحجرة في حامل المرحلة من المجهر. حدد هدف زيت NA 1.57 100X واستخدم وضع PALM في برنامج التصوير وقم بتنشيط إعدادات TIRF. تعيين عدد من الإطارات إلى 5، 000 إلى 10، 000، وقوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية إلى 0.1٪، 647 ليزر إلى 0.2٪ ومستوى كسب إلى 50 إلى 100.عند تعيين كافة معلمات الاستحواذ، قم بالتبديل إلى إضاءة الليزر وحدد خلية الهدف. للحصول على صورة، قم بزيادة قوة الليزر 647 إلى 100٪، وتقليل المكاسب إلى الصفر. قم بتبييض الخلية الهدف لمدة خمس ثوانٍ تقريباً، ثم قم بزيادة الكسب إلى 50 ثم بدء عملية الحصول على صورة PALM.لإعادة بناء بيانات PALM ، في نهاية عملية الاستحواذ ، افتح البيانات في ImageJ وافتح المكون الإضافي لـ "عاصفة رعدية". حدد تحليل التشغيل في البرنامج المساعد وفتح قائمة إعداد الكاميرا. أدخل حجم البيكسل والكسب الكهرومغناطيسي.في القائمة تحليل تشغيل، تعيين ترتيب B-spline إلى ثلاثة، مقياس B-spline إلى اثنين، عتبة شدة الذروة إلى stfwave. f1، نصف القطر المناسب إلى ثلاثة، سيجما الأولي إلى 1.6، التكبير إلى خمسة، تردد التحديث إلى 50، و shifts الجانبي إلى اثنين، وانقر فوق موافق. بعد إعادة الإعمار، حدد سيجما في قائمة الرسم البياني مؤامرة واستخدام أداة المستطيل لتحديد منطقة من الفائدة، باستثناء التحف المحتملة. إضافة المنطقة ذات الأهمية إلى عامل التصفية وإضافة وعدم اليقين أقل من 25 إلى منطقة قيم الفائدة.في علامة التبويب إزالة التكرارات، أدخل عتبة مسافة 10 نانومتر. في علامة التبويب دمج تعيين المسافة القصوى إلى 20، الحد الأقصى للإطارات لكل جزيء إلى صفر، والحد الأقصى إيقاف الإطارات إلى واحد. في علامة التبويب تصحيح الانجراف، حدد الارتباط المتبادل وقم بتعيين عدد الصناديق والتكبير إلى خمسة، ثم احفظ صورة PALM النهائية ثم تصدير بيانات ما بعد المعالجة.لتحليل طول الساركومير، قم باستيراد صورة PALM المعاد بناؤها ذات الأهمية في ImageJ واستخدم أداة الخط لرسم خط بين بنيات الساركومير المحددة عموديًا على القرص Z لقياس أقصر مسافة بين خيوط الأكمنة. في قائمة التحليل، حدد ملف رسم الرسم واكتسب الطول بين القمتين. لتحليل سمك القرص Z، قم بتحويل صورة PALM المعاد بناؤها إلى صورة وضع ثمانية بتات وفتح المكوّن الإضافي للكشف عن Ridge.تعيين عرض الخط إلى 20، التباين العالي إلى 230، التباين المنخفض إلى 10، سيجما إلى 0.79، العتبة الأدنى إلى 25.84، والحد الأدنى لطول الخط إلى 20. حدد عرض التقدير، وتوسيع الخط، وعرض النتائج، ثم انقر فوق موافق واستخدم متوسط عرض الخط من جدول النتائج لمزيد من التحليل. تظهر خلايا القلب والوليد الجذعية المشتقة من iPSC نمطًا مماثلًا من نوع ألفا أكتينين مع هياكل ساركومير غير منتظمة.التقييم الكمي يدل على أن طول وسمك خيوط أكتينين ألفا متطابقة تقريبا بين مجموعتين من الخلايا مما يدل على حالة نمو سابقة لأوانها من القلب المشتقة من iPSC. في المقابل، يعرض القلب الناضج البالغ شبكة ساركوميري عادية مع زيادة طفيفة في طول الساركومير وانخفاض سمك القرص Z. المقارنة بين التصوير confocal التقليدية و بالم يكشف عن أي فرق كبير في طول الساركومير.ومع ذلك، يتم الكشف عن عمق انخفاض سمك القرص Z عندما تتعرض أجهزة القلب iPSC للتصوير بالم. يتم ملاحظة مكسب في القرار عند تطبيق PALM، والذي يتم دعمه من قبل مخططات كثافة المقابلة. ومن الجدير بالذكر أن هياكل الساركومير التي تم الحصول عليها باستخدام مخزن عازل منخفض الجودة يبدو أكثر سمكًا مقارنة بالهياكل التي يتم التقاطها في ظروف التصوير المثلى.ويرجع هذا النقص في دقة البيانات إلى انخفاض خصائص الوميض للفلوروفور، مما يؤدي إلى عدد أقل من الفوتونات المكتشفة لكل حدث تعريب. وعلاوة على ذلك، يتم تقليل دقة التعريب، مما يقلل من الدقة الكلية لصورة PALM التي أعيد بناؤها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر الانجراف عينة توطين دقيقة من الجزيئات الفلورية مما يؤدي إلى صور ضبابية.للحصول على صور PALM المناسبة، من المهم جداً السماح بالتكرار الحراري لنظام التصوير بأكمله لتجنب الانجراف المفرط للعينة أثناء التصوير. بعد هذا الإجراء، يمكن تصوير الهياكل الخلوية الأخرى مثل الميتوكوندريا بالم للحصول على معلمات إضافية لنضوج القلب.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

تصور من خلايا خلالية لشبكة (ICC) في الفئران كاجال

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...