Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af EU's strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). Derudover støttes H.L. af FORUN-programmet for Rostock University Medical Centre (889001 og 889003) og Josef og Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. er støttet af Clinician Scientist Program af Rostock University Medical Center. R.D støttes af DFG (DA1296/6-1), DAMP Foundation, German Heart Foundation (F/01/12) og BMBF (VIP+ 00240).
Vi takker Madeleine Bartsch for hendes tekniske support i iPSC cellekultur og hjertedifferentiering.

Alle trin i denne protokol, der involverer neonatal og voksne mus blev udført i henhold til de etiske retningslinjer for dyrepleje af Rostock University Medical Centre.
1. Dyrkning og dissociation af iPSC-afledte kardiomyocytter
<ol><li>Differentiere hiPSC-CMs i 25 dage ved hjælp af en 2D monolayer metode som beskrevet tidligere17.</li>
	<li>Forvarmet dissociation medium til 37 °C og støtte medium til stuetemperatur.</li>
	<li>Vask cellerne to gange med PBS.</li>
...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

Generering af funktionelt iPSC-afledt CM in vitro er vigtigt for regenerative behandlinger, sygdomsmodellering og udvikling af lægemiddelscreeningsplatforme. Utilstrækkelig modenhed af disse cm er imidlertid en væsentlig hindring for hjerte-kar-forskning20. I den forbindelse er der behov for billeddannelsesteknikker med høj opløsning, som gør det muligt at overvåge den strukturelle modningstilstand for iPSC-afledt cm. Samtidig kan superopløsningsmikroskopi være et værdifuldt redskab til ...

Hjerte-kar-sygdomme (CVD) såsom myokardie infarkt eller kardiomyopati fortsat den vigtigste dødsårsag i den vestlige verden1. Da det menneskelige hjerte kun har dårlig regenerativ kapacitet, er der behov for strategier til at fremme inddrivelsen fra CV'er. Dette omfatter celle udskiftning behandlingsformer til at genopbygge tabte kardiomyocytter (CM), samt udvikling af nye anti-arytmiske lægemidler til effektiv og sikker farmaceutisk intervention. Induceret pluripotent stamceller (iPSC) har vist sig at være en lovende cellekilde for den ubegrænsede generation af humane CM in vitro, egnet til regenerative behandlinger, sygdom modellering, og til udvikling af narkotika screening assays2,3,4.
Selv om mange forskellige hjerte differentiering protokoller findes, iPSC-afledte CM stadig mangler visse fænotypiske og funktionelle aspekter, der hindrer in vitro og in vivo ansøgning5,6. Udover elektrofysiologiske, metaboliske og molekylære ændringer, hjertet modning proces indebærer den strukturelle organisering af sarcomeres, som er de grundlæggende enheder, der kræves for kraft generation og celle sammentrækning7. Mens voksne CMs udviser et velorganiseret kontraktapparat, iPSC-afledte CMs ofte demonstrere disarranged sarcomere filamenter, forbundet med en reduceret sammentrækning evne og ændret sammentrækning dynamik8,9. I modsætning til modne CM, der viser uniaxial sammentrækning mønster, de desorienterede strukturer i umodne CM resulterer i en radial sammentrækning af hele cellen eller fremme udseendet af sammentrækningknudepunkter 9,10.
For at forbedre hjertemodning, flere tilgange er blevet anvendt, herunder 3D-celle kultur metoder, elektrisk og mekanisk stimulation, samt brugen af ekstracellulære matricer efterligne in vivo betingelser11,,12,13. For at vurdere disse forskellige kulturbetingelsers succes og effektivitet er der behov for teknikker til at overvåge og vurdere graden af den strukturelle modning af iPSC CM, f.eks. I modsætning til konventionel konfokal billeddannelse er opløsningen i tilfælde af fotoaktiveret lokaliseringmikroskopi (PALM) ca. 10 x højere. Denne teknik giver igen mulighed for en mere præcis analyse, opdage selv subtile ændringer af cellulære strukturer14. I betragtning af den høje opløsning af PALM-baseret billeddannelse, det overordnede mål med denne metode var den mikroskopiske evaluering af sarcomere modenhed i iPSC-afledte CMs ved præcis bestemmelse af z-Disc tykkelse og sarcomere længde. I tidligere undersøgelser har disse strukturelle træk vist sig at være egnede parametre til vurdering af hjertemodenhed15. For eksempel, syge iPSC-CM mangler fuld længde dystrophin udviser reduceret sarcomere længde og z-band bredde i forhold til vilde type celler16. Ligeledes blev længden af de enkelte sarcomeres målt for at undersøge virkningen af topografiske signaler på hjerteudvikling16. Derfor har vi anvendt denne tilgang til at evaluere den strukturelle modning af sarcomere netværket i iPSC-CM ved kvantitativt at måle sarcomere længde og z-disc tykkelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

Modningen af iPSC-afledte kardiomyocytter er et kritisk problem for deres anvendelse i regenerativ behandling, testning af lægemidler og sygdomsmodellering. På trods af udviklingen af flere differentieringsprotokoller er genereringen af iPSC-kardiomyocytter, der ligner en voksenlignende fænotype, fortsat udfordrende. Et vigtigt aspekt af cardiomyocytes modning indebærer dannelsen af et velorganiseret sarcomere netværk for at sikre høj sammentrækningskapacitet. Her præsenterer vi en super løsningsbaseret tilgang til semi-kvantitativ analyse af α-actinin-netværket i kardiomyocytter. Ved hjælp af fotoaktiveret lokaliseringmikroskopi blev der foretaget en sammenligning af sarkomiske længde- og z-disc-tykkelse af iPSC-afledte kardiomyocytter og hjerteceller, der var isoleret fra neonatal væv. Samtidig viser vi vigtigheden af ordentlige billeddannelsesforhold for at opnå pålidelige data. Vores resultater viser, at denne metode er egnet til kvantitativt at overvåge den strukturelle modenhed af hjerteceller med høj rumlig opløsning, så detektion af selv subtile ændringer af sarcomere organisation.

Til vurdering af graden af strukturel modning af CM, neonatal, fuldt modne voksne, og iPSC CM blev oprindeligt mærket CM med α-actinin antistof til at visualisere sarcomere netværket. Efter PALM erhvervelse, blev billeder rekonstrueret, og z-disc tykkelse blev målt ved hjælp af plugin-baseret billedbehandling software til automatisk påvisning af bredden af de enkelte filamenter. Sarcomere længde blev beregnet ved at måle afstanden mellem to tilstødende intensitet toppe, svarende til tilstødende filamenter. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Dannelsen af et ordentligt sarkomnetværk er vigtig for modningen af iPSC-afledte kardiomyocytter. Vi præsenterer en super opløsning-baseret tilgang, der giver mulighed for kvantitativ evaluering af den strukturelle modning af stamceller afledte kardiomyocytter, for at forbedre kultur betingelser fremme hjerteudvikling.

Analyse af α-Actinin Network i Human iPSC-Afledte Kardiomyocytter ved hjælp af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Denne metode kan anvendes til kvantitativ evaluering af sarcomere modning i iPSC-afledte kardiomyocytter. Ved hjælp af denne super opløsning-baserede tilgang, er det muligt at opdage selv subtile ændringer i sarcomere organisation, hvilket ikke er muligt med konventionelle konfokale billeddannelse. Mindst tre timer før brug tændes mikroskopet, og prøven bringes i stuetemperatur.Når mikroskopet er klar, tilsættes 300 mikroliter PALM-billedbuffer til en brønd af mærkede celler, og kammersliden indsættes i mikroskopets sceneholder. Vælg 1,57 NA 100X oliemålsætningen, og brug PALM-tilstanden i billedsoftwaren, og aktivér TIRF-indstillingerne. Indstil antallet af rammer til 5.000 til 10.000, UV-lasereffekten til 0,1 % og 647-laseren til 0,2 % og forstærkningsniveauet til 50 til 100.Når alle anskaffelsesparametrene er indstillet, skal du tænde for laserbelysningen og vælge en målcelle. For at erhverve et billede, øge 647 laser magt til 100% og reducere gevinsten til nul. Blege målet celle i omkring fem sekunder, derefter øge gevinsten til 50 og indlede PALM billede erhvervelse.For rekonstruktion af PALM data, i slutningen af erhvervelsen, åbne data i ImageJ og åbne Thunderstorm plugin. Vælg kør-analyse i plugin'et, og åbn kameraopsætningsmenuen. Indtast pixelstørrelsen og den elektromagnetiske forstærkning.I menuen køre analyse, skal du indstille B-spline orden til tre, B-spline skala til to, peak intensitet tærskel til stfwave. f1, monteringsradius til tre, den oprindelige sigma til 1,6, forstørrelsen til fem, opdateringsfrekvensen til 50 og den laterale skifter til to, og klik på OK. Efter rekonstruktion skal du vælge sigma i menuen af plottet histogram og bruge rektangelværktøjet til at vælge et område af interesse, bortset fra mulige artefakter. Føj området af interesse til filteret og tilføj og usikkerhed mindre end 25 til området med interesseværdier.Under fanen Fjern dubletter skal du angive en afstandsgrænse på 10 nanometer. Under den fusionerende fane skal du indstille den maksimale afstand til 20, de maksimale rammer pr. molekyle til nul og den maksimale off frames til en. Under fanen afdriftkorrektion skal du vælge krydskorrelation og angive antallet af placeringer og forstørrelsen til fem, og gem derefter det endelige PALM-billede og eksportér dataene efter processen.For at analysere sarcomere længden, importere den rekonstruerede PALM billede af interesse i ImageJ og bruge linjen værktøjet til at tegne en linje mellem de valgte sarcomere strukturer vinkelret på Z-skiven til at måle den korteste afstand mellem actin filamenter. Vælg afbildningsprofil i analysemenuen, og anskér længden mellem de to toppe. Hvis du vil analysere Z-skivetykkelsen, skal du konvertere det rekonstruerede PALM-billede til et billede i otte bit-tilstand og åbne Plugin til registrering af ridge.Indstil linjebredden til 20, den høje kontrast til 230, den lave kontrast til 10, sigmaen til 0,79, den lavere tærskel til 25,84 og den mindste linjelængde til 20. Vælg estimatbredde, udvid linje, og få vist resultater, og klik derefter på OK, og brug middellinjebredden fra resultattabellen til yderligere analyse. iPSC-afledte kardiomyocyt- og neonatale celler udviser et lignende alfa actininmønster med uregelmæssige opløste sarkomstrukturer.Kvantitativ vurdering viser, at længden og tykkelsen af alfa actininfilamenter er næsten identiske mellem de to grupper af celler, der angiver en for tidlig udviklingstilstand af iPSC-afledte kardiomyocytter. I modsætning hertil udviser voksne modne kardiomyocytter et regelmæssigt sarkomisk netværk med en lidt øget sarkomlængde og reduceret Z-skivetykkelse. En sammenligning af konventionel konfokal billeddannelse og PALM afslører ingen signifikant forskel i sarcomere længde.Men, en dyb reduceret Z-disc tykkelse opdages, når iPSC cardiomyocytes udsættes for PALM imaging. En gevinst i opløsning er observeret, når PALM anvendes, som understøttes af den tilsvarende intensitet parceller. Især sarkomere strukturer erhvervet ved hjælp af en lav kvalitet buffer synes at være tykkere i forhold til strukturer fanget under optimale billeddannelse betingelser.Denne mangel på data nøjagtighed skyldes de reducerede blinkende egenskaber af fluorophore, hvilket resulterer i færre registrerede fotoner per lokalisering begivenhed. Desuden er lokalisering præcision reduceres, sænke den overordnede opløsning af det rekonstruerede PALM billede. Desuden kan prøvedrift påvirke den præcise lokalisering af lysstofrør, hvilket resulterer i slørede billeder.For at erhverve ordentlig PALM billeder, er det meget vigtigt at tillade termisk ækvilibrering af hele billedbehandlingssystemet for at undgå overdreven prøve drift under billeddannelse. Efter denne procedure, andre cellulære strukturer såsom mitokondrier kan afbildes af PALM at erhverve yderligere parametre for cardiomyocyte modning.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Udledning af menneskelige Hjerte prækursorer og cardiomyocytter fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionel Profilering af Voksen Mouse cardiomyocytter

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization brug af foto-aktiverede Localization mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Single-molekyle Imaging af genregulering<em&gt; In vivo</em&gt; Brug Cotranslational Aktivering ved spaltning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analyserer kraniofacial Morfogenese i zebrafisk Brug 4D konfokal mikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studere DNA Looping af Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...