Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par le Fonds structurel de l’UE (FSE/14-BM-A55-0024/18). En outre, H.L. est soutenu par le programme FORUN du Centre médical universitaire de Rostock (889001 et 889003) et la Fondation Josef et Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. est soutenu par le Programme de cliniciens-chercheurs du Centre médical de l’Université Rostock. R.D est soutenu par la DFG (DA1296/6-1), la fondation DAMP, la Fondation allemande du cœur (F/01/12) et la BMBF (VIP+ 00240).
Nous remercions Madeleine Bartsch pour son soutien technique dans la culture cellulaire iPSC et la différenciation cardiaque.

Toutes les étapes de ce protocole impliquant des souris néonatales et adultes ont été effectuées conformément aux lignes directrices éthiques pour les soins aux animaux du Centre médical de l’Université Rostock.
1. Culture et dissociation des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC
<ol><li>Différenciez hiPSC-CM pendant 25 jours à l’aide d’une méthode de monocouche 2D comme décrit précédemment17.</li>
	<li>Préwarm dissociation moyenne à 37 °C et so...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

La génération de CM in vitro fonctionnel dérivé de l’iPSC est importante pour les thérapies régénératives, la modélisation des maladies et le développement de plates-formes de dépistage des médicaments. Cependant, la maturité insuffisante de ces CM est un obstacle majeur dans la recherche cardiovasculaire20. À cet égard, des techniques d’imagerie à haute résolution sont nécessaires pour permettre la surveillance de l’état de maturation structurale du CM dérivé de l’iPS...

Les maladies cardiovasculaires (MALADIES cardiovasculaires) telles que l’infarctus du myocarde ou la cardiomyopathie demeurent la principale cause de décès dans le monde occidental1. Comme le cœur humain ne possède qu’une faible capacité de régénération, il est nécessaire de stratégies pour promouvoir la récupération des maladies cardiovasculaires. Cela comprend les thérapies de remplacement cellulaire pour reconstituer les cardiomyocytes perdus (CM), ainsi que le développement de nouveaux médicaments anti-arythmiques pour une intervention pharmaceutique efficace et sûre. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) se sont avérées être une source de cellules prometteuses pour la génération illimitée de CM humain in vitro, adaptée aux thérapies régénératrices, à la modélisation de la maladie, et au développement d’essais de dépistage des médicaments2,3,4.
Bien qu’il existe de nombreux protocoles de différenciation cardiaque différents, cm dérivé de l’iPSC manquent encore certains aspects phénotypiques et fonctionnels qui entravent l’application in vitro et in vivo5,6. À côté des changements électrophysiologiques, métaboliques et moléculaires, le processus de maturation cardiaque implique l’organisation structurelle des sarcomeres, qui sont les unités fondamentales requises pour la génération de force et la contraction cellulaire7. Alors que les CM adultes présentent un appareil contractile bien organisé, les CM dérivés d’iPSC démontrent généralement des filaments de sarcomères désarrangés, associés à une capacité de contraction réduite et à une dynamique de contraction altérée8,9. Contrairement à cm mature qui montrent le modèle de contraction uniaxiale, les structures désorientées dans cm immatures a comme conséquence une contraction radiale de la cellule entière ou favorisent l’apparition des points focaux de contraction9,10.
Pour améliorer la maturation cardiaque, de multiples approches ont été appliquées, y compris les méthodes de culture cellulaire 3D, la stimulation électrique et mécanique, ainsi que l’utilisation de matrices extracellulaires imitant les conditions in vivo11,12,13. Pour évaluer le succès et l’efficacité de ces différentes conditions culturelles, des techniques sont nécessaires pour surveiller et estimer le degré de maturation structurelle de l’iPSC CM, par exemple, par des techniques microscopiques. Contrairement à l’imagerie confocale conventionnelle, la résolution en cas de microscopie de localisation photoactivée (PALM) est environ 10x plus élevée. Cette technique permet à son tour une analyse plus précise, détectant même des altérations subtiles des structures cellulaires14. Compte tenu de la haute résolution de l’imagerie basée sur PALM, l’objectif global de cette méthode était l’évaluation microscopique de la maturité sarcomère dans les CM dérivés d’iPSC par une détermination précise de l’épaisseur du z-Disc et de la longueur du sarcomère. Dans des études antérieures, ces caractéristiques structurelles se sont avérées être des paramètres appropriés pour évaluer la maturité cardiaque15. Par exemple, iPSC-CM malade manquant de dystrophine pleine longueur présentent une longueur de sarcomère réduite et la largeur de la bande z par rapport aux cellules de type sauvage16. De même, la longueur des sarcomeres individuels a été mesurée pour étudier l’impact des signaux topographiques sur le développement cardiaque16. Par conséquent, nous avons appliqué cette approche pour évaluer la maturation structurelle du réseau sarcomère dans iPSC-CM en mesurant quantitativement la longueur du sarcomère et l’épaisseur du disque z.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

La maturation des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC est un problème critique pour leur application dans la thérapie régénérative, le dépistage des drogues et la modélisation de la maladie. Malgré le développement de multiples protocoles de différenciation, la génération de cardiomyocytes iPSC ressemblant à un phénotype semblable à un adulte demeure difficile. Un aspect majeur de la maturation des cardiomyocytes implique la formation d’un réseau sarcomère bien organisé pour assurer une grande capacité de contraction. Ici, nous présentons une approche super résolution-basée pour l’analyse semi-quantitative du réseau de α-actinine dans les cardiomyocytes. À l’aide d’une microscopie de localisation photoactivée, une comparaison de la longueur du sarcomère et de l’épaisseur du disque z des cardiomyocytes et des cellules cardiaques dérivés de l’iPSC, isolées du tissu néonatal, a été effectuée. En même temps, nous démontrons l’importance de conditions d’imagerie appropriées pour obtenir des données fiables. Nos résultats montrent que cette méthode est appropriée pour surveiller quantitativement la maturité structurelle des cellules cardiaques à haute résolution spatiale, permettant la détection de changements même subtils de l’organisation du sarcomere.

Pour estimer le degré de maturation structurelle de CM, néonatal, adulte pleinement mature, et iPSC CM ont été initialement étiquetés le CM avec α-actinine anticorps pour visualiser le réseau sarcomère. Après l’acquisition de PALM, les images ont été reconstruites, et l’épaisseur du disque z a été mesurée à l’aide d’un logiciel de traitement d’image à base de plugins pour la détection automatique de la largeur des filaments individuels. La longueur du sarcomère a été calculée en mesurant ...

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Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

La formation d’un réseau de sarcomère approprié est importante pour la maturation des cardiomyocytes dérivés d’iPSC. Nous présentons une approche super résolution qui permet l’évaluation quantitative de la maturation structurelle des cardiomyocytes dérivés de cellules souches, afin d’améliorer les conditions de culture favorisant le développement cardiaque.

Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Cette méthode peut être utilisée pour l’évaluation quantitative de la maturation du sarcome chez les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC. En utilisant cette approche basée sur la super résolution, il est possible de détecter même des altérations subtiles de l’organisation du sarcome, ce qui n’est pas possible avec l’imagerie confocal conventionnelle. Au moins trois heures avant l’utilisation, allumez le microscope et apportez l’échantillon à température ambiante.Lorsque le microscope est prêt, ajouter 300 microlitres de tampon d’imagerie PALM à un puits de cellules étiquetées et insérer la glissière de chambre dans le support de scène du microscope. Sélectionnez l’objectif d’huile 1.57 NA 100X et utilisez le mode PALM dans le logiciel d’imagerie et activez les paramètres TIRF. Réglez le nombre d’images à 5000 à 10 000, la puissance laser UV à 0,1% et le laser 647 à 0,2% et le niveau de gain à 50 à 100.Lorsque tous les paramètres d’acquisition ont été définis, allumez l’éclairage laser et sélectionnez une cellule cible. Pour acquérir une image, augmenter la puissance laser 647 à 100% et réduire le gain à zéro. Blanchir la cellule cible pendant environ cinq secondes, puis augmenter le gain à 50 et lancer l’acquisition de l’image PALM.Pour la reconstruction des données PALM, à la fin de l’acquisition, ouvrez les données d’ImageJ et ouvrez le plugin Thunderstorm. Sélectionnez l’analyse d’exécuter dans le plugin et ouvrez le menu d’installation de la caméra. Entrez la taille des pixels et le gain électromagnétique.Dans le menu d’analyse de course, réglez l’ordre B-spline à trois, l’échelle B-spline à deux, le seuil d’intensité maximale à stfwave. f1, le rayon d’ajustement à trois, le sigma initial à 1,6, le grossissement à cinq, la fréquence de mise à jour à 50, et les changements laraux à deux, et cliquez sur OK. Après la reconstruction, sélectionnez sigma dans le menu histogramme de l’intrigue et utilisez l’outil rectangle pour sélectionner une région d’intérêt, à l’exclusion des artefacts possibles. Ajouter la région d’intérêt au filtre et ajouter et l’incertitude de moins de 25 à la région des valeurs d’intérêt.Dans l’onglet supprimer les doublons, entrez un seuil de distance de 10 nanomètres. Dans l’onglet fusion, réglez la distance maximale à 20, les images maximales par molécule à zéro, et le maximum hors cadres à un. Dans l’onglet correction de dérive, sélectionnez la corrélation croisée et définissez le nombre de bacs et le grossissement à cinq, puis enregistrez l’image PALM finale et exportez les données post-processus.Pour analyser la longueur du sarcomere, importez l’image PALM reconstruite d’intérêt dans ImageJ et utilisez l’outil de ligne pour tracer une ligne entre les structures de sarcomere sélectionnées perpendiculairement au disque Z pour mesurer la distance la plus courte entre les filaments d’actine. Dans le menu d’analyse, sélectionnez le profil de l’intrigue et acquérez la longueur entre les deux pics. Pour analyser l’épaisseur du disque Z, convertissez l’image PALM reconstruite en une image en mode huit bits et ouvrez le plugin Ridge Detection.Réglez la largeur de la ligne à 20, le contraste élevé à 230, le faible contraste à 10, le sigma à 0,79, le seuil inférieur à 25,84, et la longueur minimale de la ligne à 20. Sélectionnez la largeur de l’estimation, prolongez la ligne et affichez les résultats, puis cliquez sur OK et utilisez la largeur moyenne de la ligne à partir de la table de résultats pour une analyse plus approfondie. Les cardiomyocytes et les cellules néonatales dérivés de l’iPSC présentent un modèle similaire d’actinine alpha avec des structures sarcomere désarrangées irrégulières.L’évaluation quantitative démontre que la longueur et l’épaisseur des filaments d’actinine alpha sont presque identiques entre les deux groupes de cellules indiquant un état développemental prématuré des cardiomyocytes iPSC-dérivés. En revanche, les cardiomyocytes matures adultes présentent un réseau régulier de sarcomere avec une longueur légèrement accrue de sarcomere et une épaisseur réduite de Z-disc. Une comparaison de l’imagerie confocale conventionnelle et de PALM ne révèle aucune différence significative dans la longueur du sarcomère.Cependant, une épaisseur réduite profonde de Z-disc est détectée quand les cardiomyocytes d’iPSC sont soumis à l’imagerie de PAUME. Un gain de résolution est observé lors de l’application du PALM, qui est soutenu par les parcelles d’intensité correspondantes. Notamment, les structures sarcomere acquises à l’aide d’un tampon de mauvaise qualité semblent être plus épaisses que les structures capturées dans des conditions d’imagerie optimales.Ce manque de précision des données est dû à la réduction des propriétés clignotantes du fluorophore, ce qui réduit le nombre de photons détectés par événement de localisation. En outre, la précision de localisation est diminuée, abaissant la résolution globale de l’image PALM reconstruite. En outre, la dérive de l’échantillon peut affecter la localisation précise des molécules fluorescentes résultant en images floues.Pour acquérir des images PALM appropriées, il est très important de permettre l’équilibrage thermique de l’ensemble du système d’imagerie afin d’éviter une dérive excessive de l’échantillon pendant l’imagerie. Après cette procédure, d’autres structures cellulaires telles que les mitochondries peuvent être photographiées par PALM pour acquérir des paramètres supplémentaires de maturation des cardiomyocytes.

Research

JoVE Journal

Biology

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