Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Diese Studie wurde vom EU-Strukturfonds (ESF/14-BM-A55-0024/18) unterstützt. Darüber hinaus wird H.L. durch das FORUN-Programm des Universitätsklinikums Rostock (889001 und 889003) und die Josef und Käthe Klinz Stiftung (T319/29737/2017) unterstützt. C.I.L. wird vom Clinician Scientist Program des Universitätsklinikums Rostock unterstützt. Gefördert wird die R.D. von der DFG (DA1296/6-1), der DAMP-Stiftung, der Deutschen Herzstiftung (F/01/12) und dem BMBF (VIP+ 00240).
Wir danken Madeleine Bartsch für ihre technische Unterstützung bei der iPSC-Zellkultur und der Herzdifferenzierung.

Alle Schritte in diesem Protokoll mit neonatalen und erwachsenen Mäusen wurden nach den ethischen Richtlinien für die Tierpflege des Universitätsklinikums Rostock durchgeführt.
1. Kultivierung und Dissoziation von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten
<ol><li>Differenzieren Sie hiPSC-CMs 25 Tage lang mit einer 2D-Monolayer-Methode, wie zuvorbeschrieben 17.</li>
	<li>Vorwärmedissoziation Medium bis 37 °C und unterstützen mittlere raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

Die Generierung funktioneller iPSC-abgeleiteter CM in vitro ist wichtig für regenerative Therapien, Die Krankheitsmodellierung und die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Plattformen. Jedoch, unzureichende Reife dieser CM ist ein großes Hindernis in der kardiovaskulären Forschung20. In diesem Zusammenhang sind hochauflösende Bildgebungstechniken erforderlich, die die Überwachung des strukturellen Reifungszustands von iPSC-abgeleitetem CM ermöglichen. Gleichzeitig kann die Superauflösungs...

Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) wie Myokardinfarkt oder Kardiomyopathie bleiben die Haupttodesursache in der westlichen Welt1. Da das menschliche Herz nur über schlechte Regenerationsfähigkeit verfügt, bedarf es Strategien, um die Erholung von CVDs zu fördern. Dazu gehören Zellersatztherapien zur Auffüllung verlorener Kardiomyozyten (CM) sowie die Entwicklung neuer antiarrhythmischer Medikamente für eine effiziente und sichere pharmazeutische Intervention. Induzierte pluripotente Stammzelle (iPSC) haben sich als vielversprechende Zellquelle für die unbegrenzte Generierung von humanem CM in vitro erwiesen, geeignet für regenerative Therapien, Krankheitsmodellierung, und für die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Assays2,3,4.
Obwohl es viele verschiedene kardiale Differenzierungsprotokolle gibt, fehlt es iPSC-abgeleitetem CM noch immer an bestimmten phänotypischen und funktionellen Aspekten, die die In-vitro- und In-vivo-Anwendung behindern5,6. Neben elektrophysiologischen, metabolischen und molekularen Veränderungen beinhaltet der Herzreifungsprozess die strukturelle Organisation von Sarkomen, die die grundlegenden Einheiten sind, die für die Kraftgenerierung und Zellkontraktion erforderlich sind7. Während erwachsene CMs ein gut organisiertes kontraktiles Gerät aufweisen, zeigen iPSC-abgeleitete CMs häufig disarrangierte Sarcomere-Filamente, die mit einer reduzierten Kontraktionsfähigkeit und veränderten Kontraktionsdynamik8,9verbunden sind. Im Gegensatz zu reifen CM, die uniaxiale Kontraktionsmuster zeigen, führen die desorientierten Strukturen in unreifen CM zu einer radialen Kontraktion der ganzen Zelle oder fördern das Auftreten von Kontraktionsschwerpunkten9,10.
Zur Verbesserung der Herzreife wurden mehrere Ansätze angewendet, einschließlich 3D-Zellkulturmethoden, elektrische und mechanische Stimulation sowie die Verwendung extrazellulärer Matrizen, die in vivo Bedingungen11,12,13imitieren. Um den Erfolg und die Effizienz dieser verschiedenen Kulturbedingungen zu bewerten, sind Techniken erforderlich, um den Grad der strukturellen Reifung von iPSC CM zu überwachen und abzuschätzen, z. B. durch mikroskopische Techniken. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen Bildgebung ist die Auflösung bei der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) etwa 10-fach höher. Diese Technik wiederum ermöglicht eine genauere Analyse, die auch subtile Veränderungen der zellulären Strukturen erkennt14. Unter Berücksichtigung der hohen Auflösung der PALM-basierten Bildgebung war das übergeordnete Ziel dieser Methode die mikroskopische Bewertung der Sarkomereife in iPSC-abgeleiteten CMs durch präzise Bestimmung der Z-Scheibendicke und Sarcomere-Länge. In früheren Studien haben sich diese strukturellen Merkmale als geeignete Parameter zur Beurteilung der Herzreife erwiesen15. Zum Beispiel, kranke iPSC-CM fehlt volle Länge Dystrophin zeigen reduzierte Sarcomere Länge und Z-Bandbreite Breite im Vergleich zu Wild-Typ-Zellen16. Ebenso wurde die Länge der einzelnen Sarkome gemessen, um die Auswirkungen topografischer Hinweise auf die Herzentwicklung zu untersuchen16. Daher haben wir diesen Ansatz angewandt, um die strukturelle Reifung des Sarcomere-Netzwerks in iPSC-CM zu bewerten, indem wir die Sarcomere-Länge und die Z-Scheibendicke quantitativ messen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

Die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist ein kritisches Thema für ihre Anwendung in der regenerativen Therapie, Medikamententests und Krankheitsmodellierung. Trotz der Entwicklung mehrerer Differenzierungsprotokolle bleibt die Erzeugung von iPSC-Kardiomyozyten, die einem erwachsenen Phänotyp ähneln, eine Herausforderung. Ein wichtiger Aspekt der Kardiomyozytenreifung ist die Bildung eines gut organisierten Sarcomere-Netzwerks, um eine hohe Kontraktionskapazität zu gewährleisten. Hier stellen wir einen super auflösungsbasierten Ansatz für die semiquantitative Analyse des α-Actinin-Netzwerks in Kardiomyozyten vor. Mit hilfe der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie wurde ein Vergleich der Sarkomelänge und der Z-Scheibendicke von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und herzisolierten Herzzellen aus neonatalem Gewebe durchgeführt. Gleichzeitig zeigen wir, wie wichtig geeignete Bildgebungsbedingungen sind, um zuverlässige Daten zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Methode geeignet ist, die strukturelle Reife von Herzzellen mit hoher räumlicher Auflösung quantitativ zu überwachen, was den Nachweis selbst subtiler Veränderungen der Sarcomere-Organisation ermöglicht.

Zur Schätzung des Grades der strukturellen Reifung von CM wurden neonatale, vollreife Erwachsene und iPSC CM zunächst als CM mit α-Actinin-Antikörper nazierend, um das Sarcomere-Netzwerk zu visualisieren. Nach der PALM-Erfassung wurden Bilder rekonstruiert und die Z-Scheibendicke mit einer Plugin-basierten Bildverarbeitungssoftware zur automatischen Erfassung der Breite einzelner Filamente gemessen. Die Sarcomere-Länge wurde berechnet, indem der Abstand zwischen zwei benachbarten Intensitätsspitzen gemessen wurde, ...

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Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Die Bildung eines richtigen Sarcomere-Netzwerks ist wichtig für die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Wir präsentieren einen super Auflösungs-basierten Ansatz, der die quantitative Bewertung der strukturellen Reifung von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ermöglicht, um die Kulturbedingungen zu verbessern, die die Herzentwicklung fördern.

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Diese Methode kann für die quantitative Bewertung der Sarcomere-Reifung in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten verwendet werden. Mit diesem super Auflösungs-basierten Ansatz ist es möglich, auch subtile Veränderungen in der Sarcomere-Organisation zu erkennen, was mit konventioneller konfokaler Bildgebung nicht möglich ist. Mindestens drei Stunden vor Gebrauch das Mikroskop einschalten und die Probe auf Raumtemperatur bringen.Wenn das Mikroskop fertig ist, fügen Sie 300 Mikroliter PALM-Bildgebungspuffer in einen Brunnen von beschrifteten Zellen ein und legen Sie das Kammerschlitten in den Bühnenhalter des Mikroskops ein. Wählen Sie das Ölobjektiv 1.57 NA 100X aus, verwenden Sie den PALM-Modus in der Bildverarbeitungssoftware und aktivieren Sie die TIRF-Einstellungen. Stellen Sie die Anzahl der Frames auf 5.000 bis 10.000, die UV-Laserleistung auf 0,1 % und den 647-Laser auf 0,2 % und die Verstärkungsstufe auf 50 bis 100.Wenn alle Erfassungsparameter eingestellt sind, schalten Sie die Laserbeleuchtung ein und wählen Sie eine Zielzelle aus. Um ein Bild zu erhalten, erhöhen Sie die 647 Laserleistung auf 100 % und reduzieren Sie den Gewinn auf Null. Bleichen Sie die Zielzelle für etwa fünf Sekunden, erhöhen Sie dann den Gewinn auf 50 und initiieren Sie die PALM-Bildaufnahme.Für die Rekonstruktion der PALM-Daten, am Ende der Erfassung, öffnen Sie die Daten in ImageJ und öffnen Sie das Thunderstorm Plugin. Wählen Sie die Ausführungsanalyse im Plugin aus und öffnen Sie das Kamera-Setup-Menü. Geben Sie die Pixelgröße und die elektromagnetische Verstärkung ein.Legen Sie im Menü für die Ausführungsanalyse die B-Spline-Reihenfolge auf drei, die B-Spline-Skala auf zwei, die Spitzenintensitätsschwelle auf stfwave fest. f1, der Anpassungsradius auf drei, das anfängliche Sigma auf 1,6, die Vergrößerung auf fünf, die Aktualisierungsfrequenz auf 50 und die seitliche Verschiebung auf zwei, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie nach der Rekonstruktion Sigma im Diagrammhistogrammmenü aus, und verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um einen Interessenbereich auszuwählen, der mögliche Artefakte ausschließt. Fügen Sie dem Filter die Interessenregion hinzu, und fügen Sie der Region mit Zinswerten weniger als 25 hinzu.Geben Sie auf der Registerkarte Duplikate entfernen einen Abstandsschwellenwert von 10 Nanometern ein. Legen Sie in der Registerkarte Zusammenführen den maximalen Abstand auf 20, die maximalen Frames pro Molekül auf Null und die maximalen Off-Frames auf einen. Wählen Sie auf der Registerkarte Driftkorrektur die Kreuzkorrelation aus, und legen Sie die Anzahl der Abschnitte und die Vergrößerung auf fünf fest, speichern Sie dann das endgültige PALM-Bild und exportieren Sie die Post-Process-Daten.Um die Sarkome-Länge zu analysieren, importieren Sie das rekonstruierte PALM-Bild von Interesse in ImageJ und verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie zwischen den ausgewählten Sarcomere-Strukturen senkrecht zur Z-Scheibe zu zeichnen, um den kürzesten Abstand zwischen den Aktin-Filamenten zu messen. Wählen Sie im Analysemenü das Diagrammprofil aus und erfassen Sie die Länge zwischen den beiden Spitzen. Um die Dicke der Z-Disc zu analysieren, konvertieren Sie das rekonstruierte PALM-Bild in ein Acht-Bit-Modus-Bild und öffnen Sie das Ridge Detection Plugin.Legen Sie die Linienbreite auf 20, den hohen Kontrast auf 230, den niedrigen Kontrast auf 10, das Sigma auf 0,79, den unteren Schwellenwert auf 25,84 und die minimale Linienlänge auf 20 fest. Wählen Sie die Vorkalkulationsbreite aus, erweitern Sie die Linie und zeigen Sie die Ergebnisse an, klicken Sie dann auf OK, und verwenden Sie die mittlere Linienbreite aus der Ergebnistabelle für die weitere Analyse. iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten- und Neonatalzellen weisen ein ähnliches Alpha-Actinin-Muster mit unregelmäßig enden den sarkomre Strukturen auf.Die quantitative Bewertung zeigt, dass Länge und Dicke der Alpha-Actinin-Filamente zwischen den beiden Zellgruppen nahezu identisch sind, was auf einen vorzeitigen Entwicklungszustand von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten hindeutet. Im Gegensatz dazu weisen erwachsene reife Kardiomyozyten ein regelmäßiges Sarcomere-Netzwerk mit einer leicht erhöhten Sarcomere-Länge und reduzierter Z-Scheibendicke auf. Ein Vergleich der konventionellen konfokalen Bildgebung und PALM zeigt keinen signifikanten Unterschied in der Sarcomere-Länge.Eine tief reduzierte Z-Scheibendicke wird jedoch erkannt, wenn iPSC-Kardiomyozyten der PALM-Bildgebung unterzogen werden. Eine Auflösungszunahme wird beobachtet, wenn PALM angewendet wird, was von den entsprechenden Intensitätsdiagrammen unterstützt wird. Insbesondere Sarcomere-Strukturen, die mit einem Puffer niedriger Qualität erworben wurden, scheinen dicker zu sein als Strukturen, die unter optimalen bildgebenden Bedingungen erfasst wurden.Dieser Mangel an Datengenauigkeit ist auf die reduzierten Blinkeigenschaften des Fluorophors zurückzuführen, was zu weniger erkannten Photonen pro Lokalisierungsereignis führt. Darüber hinaus wird die Lokalisierungsgenauigkeit verringert, wodurch die Gesamtauflösung des rekonstruierten PALM-Bildes verringert wird. Darüber hinaus kann probendrift die genaue Lokalisierung der fluoreszierenden Moleküle beeinflussen, was zu verschwommenen Bildern führt.Um richtige PALM-Bilder zu erfassen, ist es sehr wichtig, eine thermische Ausgleichehebung des gesamten Bildgebungssystems zu ermöglichen, um übermäßige Probendrift während der Bildgebung zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können andere zelluläre Strukturen wie Mitochondrien von PALM abgebildet werden, um zusätzliche Parameter der Kardiomyozytenreifung zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Forschung

Biologie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...