Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן המבנית של האיחוד האירופי (ESF/14-BM-A55-0024/18). בנוסף, H.L. נתמכת על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001 ו 889003) וקרן יוזף וקתה קלינץ (T319/29737/2017). C.I.L. נתמך על ידי תוכנית המדען הקליני של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק. R.D נתמכת על ידי ה-DFG (DA1296/6-1), קרן DAMP, קרן הלב הגרמנית (F/01/12) וה-BMBF (VIP+ 00240).
אנו מודים מדלן Bartsch על התמיכה הטכנית שלה בתרבות תאי iPSC ובידול לב.

כל הצעדים בפרוטוקול זה מעורבים עכברים יילודים ומבוגרים בוצעו על פי ההנחיות האתיות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק.
1. טיפוח ופירוק של קרדיומיוציטים הנגזרים מ-iPSC
<ol><li>הבדיל hiPSC-CMs במשך 25 ימים באמצעות שיטת מונומרד דו-מיו-מיתי כמתוארקודם לכן 17</s...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

הדור של CM פונקציונלי נגזר iPSC במבחנה חשוב עבור טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות ופיתוח של פלטפורמות סינון סמים. עם זאת, בגרות לא מספיקה של CM אלה הוא מכשול מרכזי במחקר לב וכלידם 20. בהקשר זה, דרושות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניטור של מצב ההתבגרות המבנית של CM הנגזר מ-iPSC....

מחלות לב וכלי דם (CVD) כגון אוטם שריר הלב או קרדיומיופתיה להישאר הגורם העיקרי למוות בעולם המערבי1. מכיוון שללב האנושי יש יכולת התחדשות ירודה בלבד, יש צורך באסטרטגיות לקידום ההתאוששות מ-CVDs. זה כולל טיפולים להחלפת תאים כדי לחדש את קרדיומיוציטים אבודים (CM), כמו גם את הפיתוח של תרופות אנטי-קצביות חדשות להתערבות יעילה ובטוחה בסמים. המושרה תאי גזע pluripotent (iPSC) הוצגו כמקור תא מבטיח לדור בלתי מוגבל של CM אנושי במבחנה, מתאים טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות, ופיתוח של תרופות הקרנה assays2,,3,,4.
למרות פרוטוקולים רבים ושונים של בידול לב קיימים, CM נגזר iPSC עדיין חסר היבטים פנוטיפיים ופונקציונליים מסוימים המנועים במבחנה וביישום vivo5,6. לצד שינויים אלקטרופיזיולוגיים, מטבוליים ומולקולריים, תהליך ההתבגרות הלברית כרוך בארגון המבני של סרקומרים, שהם היחידות הבסיסיות הנדרשות להדרת כוח והתכווצותתאים 7. בעוד CMs למבוגרים להפגין מערכת התכווצות מאורגן היטב, CMs נגזר iPSC בדרך כלל להפגין נרים סרקום פירוק, הקשורים יכולת התכווצות מופחתת דינמיקת התכווצותשונה 8,9. בניגוד ל-CM בוגר ההראה תבנית התכווצות חד-אקסיאלית, המבנים המבולבלים ב-CM לא בוגר גורמת להתכווצות רדיאלית של התא כולו או מקדמים את הופעתם שלנקודות מוקד התכווצות 9,10.
לשיפור התבגרות הלב, גישות מרובות הוחלו, כולל שיטות תרבות תא 3D, גירוי חשמלי ומכני, כמו גם את השימוש מטריצות חוץ תאיות מחקה בתנאי vivo11,12,13. כדי להעריך את ההצלחה והיעילות של תנאי תרבות שונים אלה, יש צורך בטכניקות כדי לפקח ולהעריך את מידת ההתבגרות המבנית של iPSC CM, למשל, על ידי טכניקות מיקרוסקופיות. בניגוד להדמיה קונבנציונלית, הרזולוציה במקרה של מיקרוסקופיה פוטואקטיבית לתיקליזציה (PALM) גבוהה בכ-10 פעמים. טכניקה זו בתורה מאפשרת ניתוח מדויק יותר, זיהוי שינויים עדינים אפילו של מבנים תאיים14. בהתחשב ברזולוציה גבוהה של הדמיה מבוססת PALM, המטרה הכוללת של שיטה זו הייתה הערכה מיקרוסקופית של בגרות sarcomere ב-iPSC נגזר CMs על ידי קביעה מדויקת של עובי z-Disc ואורך sarcomere. במחקרים קודמים, תכונות מבניות אלה הראו להיות פרמטרים מתאימים כדי להעריך את בגרות הלב15. לדוגמה, iPSC-CM מחלה חסר תצוגת דיסטרופין באורך מלא מופחת אורך sarcomere ורוחב z-band בהשוואה לתאי סוג בר16. כמו כן, אורך סרקומרים בודדים נמדד כדי לחקור את ההשפעה של רמזים טופוגרפיים על התפתחות הלב16. לפיכך, יישם גישה זו כדי להעריך את ההתבגרות המבנית של רשת sarcomere ב iPSC-CM על ידי מדידה כמותית של אורך sarcomere ועובי z-disc.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

ההתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC היא בעיה קריטית עבור היישום שלהם בטיפול רגנרטיבי, בדיקות סמים ומידול מחלות. למרות הפיתוח של פרוטוקולי בידול מרובים, הדור של קרדיומיוציטים iPSC הדומה לפנוטיפ כמו מבוגר נשאר מאתגר. אחד ההיבטים העיקריים של התבגרות cardiomyocytes כרוך היווצרות של רשת sarcomere מאורגן היטב כדי להבטיח קיבולת התכווצות גבוהה. כאן, אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר לניתוח חצי כמותי של רשת α-actin ב cardiomyocytes. באמצעות מיקרוסקופית מקומיות פוטואקטיבית השוואה של אורך sarcomere ועובי z-disc של קרדיומיוציטים נגזר iPSC ותאי לב מבודדים רקמת יילודים בוצע. במקביל, אנו מדגימים את החשיבות של תנאי הדמיה נאותים להשגת נתונים אמינים. התוצאות שלנו מראות כי שיטה זו מתאימה לניטור כמותי של הבשלות המבנית של תאי לב ברזולוציה מרחבית גבוהה, המאפשרת זיהוי של שינויים עדינים אף יותר של ארגון sarcomere.

להערכת מידת ההתבגרות המבנית של CM, יילודים, מבוגר בוגר לחלוטין, ו- iPSC CM סומנו בתחילה CM עם נוגדן α-actinin כדי לדמיין את רשת sarcomere. לאחר רכישת PALM, התמונות שוחזרו, ועובי z-disc נמדד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מבוססת תוסף לזיהוי אוטומטי של רוחב של ניביים בודדים. אורך Sarcomere חושב על ידי מדידת המרחק בין שתי פ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.

ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

שיטה זו יכולה לשמש להערכה כמותית של התבגרות סרקומר בקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC. באמצעות גישה זו מבוססת רזולוציה סופר, ניתן לזהות אפילו שינויים עדינים בארגון sarcomere, אשר אינו אפשרי עם הדמיה קונפוקל קונבנציונאלי. לפחות שלוש שעות לפני השימוש, להפעיל את המיקרוסקופ ולהביא את המדגם לטמפרטורת החדר.כאשר המיקרוסקופ מוכן, הוסף 300 מיקרוליטרים של מאגר הדמיית PALM ל הבאר של תאים מסומנים והכנס את שקופית התא למחזיק הבמה של המיקרוסקופ. בחר את המטרה 1.57 NA 100X שמן ולהשתמש במצב PALM בתוכנת ההדמיה ולהפעיל את הגדרות TIRF. הגדר את מספר המסגרות ל- 5, 000 עד 10, 000, את כוח הלייזר של UV ל- 0.1% ואת הלייזר 647 ל- 0.2% ואת רמת הרווח ל- 50 עד 100.לאחר הגדרת כל פרמטרי הרכישה, הפעל את תאורת הלייזר ובחר תא יעד. כדי להשיג תמונה, הגדל את כוח הלייזר של 647 ל- 100% והפחת את הרווח לאפס. להלבין את תא היעד במשך כחמש שניות, ולאחר מכן להגדיל את הרווח ל 50 וליזום את רכישת תמונת PALM.לשחזור נתוני PALM, בסוף הרכישה, לפתוח את הנתונים ב ImageJ ולפתוח את תוסף סופת רעמים. בחר ניתוח הפעלה בתוסף ופתח את תפריט הגדרת המצלמה. הזן את גודל הפיקסל ואת הרווח האלקטרומגנטי.בתפריט ניתוח הריצה, הגדר את סדר ה- B-spline לשלושה, את קנה המידה של B-spline לשניים, את סף עוצמת השיא ל- stfwave. f1, רדיוס ההתאמה לשלוש, הסיגמא הראשוני ל-1.6, ההגדלה לחמש, תדירות העדכון ל-50 והשינויים הצדדיים לשניים, ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר השחזור, בחרו סיגמא בתפריט היסטוגרמת העלילה ולהשתמש בכלי המלבן לבחירת אזור מעניין, למעט ממצאים אפשריים. הוסף את אזור העניין למסנן והוסף ואי-ודאות הנמוכה מ- 25 לאזור ערכי הריבית.בכרטיסיה הסרת כפילויות, הזן סף מרחק של 10 ננומטר. בכרטיסיה מיזוג, הגדר את המרחק המרבי ל- 20, את המסגרות המרביות לכל מולקולה לאפס ואת המסגרות המרביות כבויות לאחת. בכרטיסייה תיקון להיסחף, בחר מתאם צולב והגדר את מספר הפחים וההגדלה לחמישה, ולאחר מכן שמור את תמונת PALM הסופית וייצא את הנתונים שלאחר התהליך.כדי לנתח את אורך הסרקומר, יבא את תמונת PALM המשוחזרת המשוחזרת של עניין ל- ImageJ ולהשתמש בכלי הקו כדי למתוח קו בין מבני הסרקומר שנבחרו בניצב לדיסק Z כדי למדוד את המרחק הקצר ביותר בין תריסי actin. בתפריט הניתוח, בחר פרופיל התוויה והרכוש את האורך בין שתי הפסגות. כדי לנתח את עובי דיסק Z, המר את תמונת PALM המשוחזרת לתמונה במצב שמונה סיביות ופתח את תוסף זיהוי הרכס.הגדר את רוחב הקו ל- 20, את החדות הגבוהה ל- 230, את החדות הנמוכה ל- 10, את הסיגמא ל- 0.79, את הסף התחתון ל- 25.84 ואת אורך השורה המינימלי ל- 20. בחר רוחב הערכה, הרחב קו והצג תוצאות ולאחר מכן לחץ על אישור ולהשתמש ברוחב הקו הממוצע מטבלת התוצאות לצורך ניתוח נוסף. תאי קרדיומיוציט יילודים שמקורם ב-iPSC מפגינים תבנית אלפא אקטינין דומה עם מבני סרקומרים לא סדירים שאינם מנומקים.הערכה כמותית מראה כי האורך והעובי של תווי אלפא actinin הם כמעט זהים בין שתי קבוצות של תאים המציין מצב התפתחותי מוקדם של cardiomyocytes נגזר iPSC. לעומת זאת, קרדיומיוציטים בוגרים מציגים רשת סרקומרים רגילה עם אורך סרקומר מעט מוגבר ועובי Z-דיסק מופחת. השוואה של הדמיה קונפוקל קונבנציונלי PALM מגלה שום הבדל משמעותי באורך sarcomere.עם זאת, עובי עמוק מופחת Z-דיסק מזוהה כאשר קרדיומיוציטים iPSC כפופים הדמיה PALM. רווח ברזולוציה נצפית בעת החלת PALM, הנתמכת על-ידי החלקות העוצמה המתאימות. יש לציין כי מבני סרקומר שנרכשו באמצעות מאגר באיכות נמוכה נראים עבים יותר בהשוואה למבנים שנתפסו בתנאי הדמיה אופטימליים.חוסר דיוק נתונים זה נובע מהמאפיינים המהבהבים המופחתים של הפלואורופור, וכתוצאה מכך פחות פוטונים שזוהו לכל אירוע לוקליזציה. יתר על כן, דיוק לוקליזציה הוא ירד, הפחתת הרזולוציה הכוללת של תמונת PALM משוחזר. בנוסף, סחף מדגם יכול להשפיע על לוקליזציה מדויקת של מולקולות פלואורסצנטי וכתוצאה מכך תמונות מטושטשות.כדי לרכוש תמונות PALM נאותה, חשוב מאוד לאפשר שיווי משקל תרמי של מערכת ההדמיה כולה, כדי למנוע סחף מדגם מוגזם במהלך הדמיה. בעקבות הליך זה, מבנים תאיים אחרים כגון המיטוכונדריה ניתן לדמיין על ידי PALM לרכוש פרמטרים נוספים של התבגרות cardiomyocyte.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

ויזואליזציה של תאים ביניים של רשת (ICC) קחאל ב עכברים

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...