Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal Fondo strutturale dell'UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Inoltre, H.L. è supportato dal programma FORUN del Rostock University Medical Centre (889001 e 889003) e dalla Fondazione Josef e K'the Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. è supportato dal Programma Scienziato Cliniciano del Rostock University Medical Center. R.D è supportato dal DFG (DA1296/6-1), dalla fondazione DAMP, dalla German Heart Foundation (F/01/12) e dal BMBF (VIP 00240).
Ringraziamo Madeleine Bartsch per il suo supporto tecnico nella coltura cellulare iPSC e nella differenziazione cardiaca.

Tutte le fasi di questo protocollo che coinvolgono topi neonatali e adulti sono state eseguite secondo le linee guida etiche per la cura degli animali del Rostock University Medical Centre.
1. Coltivazione e dissociazione di cardiomiociti derivati da iPSC
<ol><li>Differenziare i hiPSC-CM per 25 giorni utilizzando un metodo monostrato 2D come descritto in precedenza17.</li>
	<li>Dissociazione prebellico medio a 37 gradi centigradi e supporto a temperatura medio-ambient...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

La generazione di CM in vitro funzionale derivata da iPSC è importante per le terapie rigenerative, la modellazione delle malattie e lo sviluppo di piattaforme di screening farmacologico. Tuttavia, la maturità insufficiente di questi CM è un ostacolo importante nella ricerca cardiovascolare20. A questo proposito, sono necessarie tecniche di imaging ad alta risoluzione che consentano il monitoraggio dello stato di maturazione strutturale del CM derivato da iPSC. Allo stesso tempo, la microscopia...

Le malattie cardiovascolari (CVD) come l'infarto miocardico o la cardiomiopatia rimangono la principale causa di morte nel mondo occidentale1. Poiché il cuore umano possiede solo una scarsa capacità rigenerativa, c'è bisogno di strategie per promuovere il recupero dalle CVD. Questo include terapie di sostituzione cellulare per ricostituire cardiomiociti persi (CM), così come lo sviluppo di nuovi farmaci anti-aritmici per un intervento farmaceutico efficiente e sicuro. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno dimostrato di essere una fonte di cellule promettente per la generazione illimitata di CM umano in vitro, adatta per terapie rigenerative, modellazione della malattia e per lo sviluppo di saggi di screening farmacologico2,3,4.
Sebbene esistano molti protocolli di differenziazione cardiaca diversi, il CM derivato da iPSC manca ancora di alcuni aspetti fenotipici e funzionali che ostacolano l'applicazione in vitro e in vivo5,6. Oltre ai cambiamenti elettrofisiologici, metabolici e molecolari, il processo di maturazione cardiaca coinvolge l'organizzazione strutturale dei sarcomere, che sono le unità fondamentali necessarie per la generazione di forza e la contrazionecellulare 7. Mentre le CCI adulte presentano un apparato contrattile ben organizzato, i CM derivati da iPSC dimostrano comunemente filamenti di sarcomero disarrangiati, associati a una ridotta capacità di contrazione e dinamiche di contrazionealterate 8,9. A differenza del CM maturo che mostra un modello di contrazione noniassiale, le strutture disorientate in CM immaturo si traduce in una contrazione radiale dell'intera cellula o promuovono la comparsa di punti focali di contrazione9,10.
Per migliorare la maturazione cardiaca, sono stati applicati diversi approcci, tra cui i metodi di coltura cellulare 3D, la stimolazione elettrica e meccanica, nonché l'uso di matrici extracellulari che imitano le condizioni di vivo11,12,13. Per valutare il successo e l'efficienza di queste diverse condizioni di coltura, sono necessarie tecniche per monitorare e stimare il grado di maturazione strutturale di iPSC CM, ad esempio con tecniche microscopiche. A differenza dell'imaging confocale convenzionale, la risoluzione in caso di microscopia fotoattivata di localizzazione (PALM) è di circa 10 volte superiore. Questa tecnica a sua volta consente un'analisi più accurata, rilevando anche sottili alterazioni delle strutture cellulari14. Considerando l'alta risoluzione dell'imaging basato su PALM, l'obiettivo generale di questo metodo era la valutazione microscopica della maturità del sarcomere nei CM derivati da iPSC mediante una determinazione precisa dello spessore z-Disco e della lunghezza del sarcomere. Negli studi precedenti, queste caratteristiche strutturali hanno dimostrato di essere parametri appropriati per valutare la maturità cardiaca15. Ad esempio, iPSC-CM a base di distrofina a lunghezza intera presentano una lunghezza del sarcomere e una larghezza della banda z ridotte rispetto alle celle di tiposelvaggio 16. Allo stesso modo, la lunghezza dei singoli sarcomere è stata misurata per studiare l'impatto dei segnali topografici sullo sviluppo cardiaco16. Quindi, abbiamo applicato questo approccio per valutare la maturazione strutturale della rete sarcomere in iPSC-CM misurando quantitativamente la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

La maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC è un problema critico per la loro applicazione nella terapia rigenerativa, nel test farmacologico e nella modellazione della malattia. Nonostante lo sviluppo di più protocolli di differenziazione, la generazione di cardiomiociti iPSC simile a un fenotipo adulto rimane impegnativa. Un aspetto importante della maturazione dei cardiomiociti riguarda la formazione di una rete di sarcomi ben organizzata per garantire un'elevata capacità di contrazione. Qui, presentiamo un approccio basato sulla risoluzione super per l'analisi semi-quantitativa della α-actinin nei cardiomiociti. Utilizzando la microscopia di localizzazione fotoattivata è stato eseguito un confronto tra la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z dei cardiomiociti derivati da iPSC e delle cellule cardiache isolate dal tessuto neonatale. Allo stesso tempo, dimostriamo l'importanza di condizioni di imaging adeguate per ottenere dati affidabili. I nostri risultati mostrano che questo metodo è adatto a monitorare quantitativamente la maturità strutturale delle cellule cardiache con alta risoluzione spaziale, consentendo il rilevamento di cambiamenti anche sottili dell'organizzazione dei sarcome.

Per stimare il grado di maturazione strutturale di CM, adulto neonatale, adulto completamente maturo, e iPSC CM sono stati inizialmente etichettati il CM con anticorpo α-actinin per visualizzare la rete di sarcomere. In seguito all'acquisizione di PALM, le immagini sono state ricostruite e lo spessore del disco z è stato misurato utilizzando un software di elaborazione delle immagini basato su plugin per il rilevamento automatico della larghezza dei singoli filamenti. La lunghezza del sarcomere è stata calcolata misur...

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Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

La formazione di una corretta rete di sarcomi è importante per la maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC. Presentiamo un approccio basato sulla super risoluzione che consente la valutazione quantitativa della maturazione strutturale dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali, per migliorare le condizioni di coltura che promuovono lo sviluppo cardiaco.

Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Questo metodo può essere utilizzato per la valutazione quantitativa della maturazione del sarcomero nei cardiomiociti derivati dall'iPSC. Utilizzando questo approccio basato sulla super risoluzione, è possibile rilevare anche sottili alterazioni nell'organizzazione del sarcomero, che non è possibile con l'imaging confocale convenzionale. Almeno tre ore prima dell'uso, accendere il microscopio e portare il campione a temperatura ambiente.Quando il microscopio è pronto, aggiungere 300 microlitri di tampone di imaging PALM a un pozzo di celle etichettate e inserire la diapositiva della camera nel supporto del palco del microscopio. Selezionare l'obiettivo dell'olio 1.57 NA 100X e utilizzare la modalità PALM nel software di imaging e attivare le impostazioni TIRF. Impostare il numero di fotogrammi su 5.000 a 10.000, la potenza del laser UV allo 0,1% e il laser 647 allo 0,2% e il livello di guadagno a 50 a 100.Una volta impostati tutti i parametri di acquisizione, accendere l'illuminazione laser e selezionare una cella di destinazione. Per acquisire un'immagine, aumentare la potenza laser 647 al 100% e ridurre il guadagno a zero. Sbiancare la cella di destinazione per circa cinque secondi, quindi aumentare il guadagno a 50 e avviare l'acquisizione dell'immagine PALM.Per la ricostruzione dei dati PALM, al termine dell'acquisizione, aprire i dati in ImageJ e aprire il plugin Thunderstorm. Selezionare Esegui analisi nel plug-in e aprire il menu di configurazione della fotocamera. Immettere la dimensione dei pixel e il guadagno elettromagnetico.Nel menu analisi di esecuzione, impostate l'ordine B-spline su tre, la scala B-spline su due, la soglia di intensità di picco su stfwave. f1, il raggio del raccordo a tre, il sigma iniziale a 1,6, l'ingrandimento a cinque, la frequenza di aggiornamento a 50 e il laterale si sposta su due e fare clic su OK. Dopo la ricostruzione, selezionate sigma nel menu dell'istogramma del plottaggio e utilizzate lo strumento rettangolo per selezionare un'area di interesse, escludendo possibili artefatti. Aggiungere l'area di interesse al filtro e aggiungere e incertezza inferiore a 25 ai valori dell'area di interesse.Nella scheda rimuovi duplicati immettere una soglia di distanza di 10 nanometri. Nella scheda unione, impostate la distanza massima su 20, i fotogrammi massimi per molecola su zero e il massimo dei fotogrammi spenti su uno. Nella scheda correzione deriva selezionare la correlazione incrociata e impostare il numero di collocazioni e l'ingrandimento su cinque, quindi salvare l'immagine PALM finale ed esportare i dati post-processo.Per analizzare la lunghezza del sarcomero, importate l'immagine PALM ricostruita di interesse in ImageJ e utilizzate lo strumento linea per tracciare una linea tra le strutture sarcomere selezionate perpendicolari al disco Z per misurare la distanza più breve tra i filamenti di actina. Nel menu analisi, selezionate il profilo del plottaggio e acquistete la lunghezza tra i due picchi. Per analizzare lo spessore del disco Z, convertire l'immagine PALM ricostruita in un'immagine in modalità a otto bit e aprire il plug-in Rilevamento cresta.Impostare la larghezza della linea su 20, il contrasto elevato su 230, il contrasto basso su 10, il sigma su 0,79, la soglia inferiore a 25,84 e la lunghezza minima della linea a 20. Selezionare la larghezza della stima, estendere la linea e visualizzare i risultati, quindi fare clic su OK e utilizzare la larghezza media della linea dalla tabella dei risultati per ulteriori analisi. Le cellule cardiomiocite e neonatale derivate da iPSC mostrano un simile modello di actina alfa con strutture sarcomere irregolari disarranged.La valutazione quantitativa dimostra che la lunghezza e lo spessore dei filamenti di alfa actinaina sono quasi identici tra i due gruppi di cellule che indicano uno stato di sviluppo prematuro dei cardiomiociti derivati dall'iPSC. Al contrario, i cardiomiociti maturi adulti mostrano una rete di sarcomei regolare con una lunghezza del sarcomero leggermente aumentata e uno spessore del disco Z ridotto. Un confronto tra imaging confocale convenzionale e PALM non rivela differenze significative nella lunghezza del sarcomero.Tuttavia, viene rilevato un profondo spessore ridotto del disco Z quando i cardiomiociti iPSC sono sottoposti all'imaging PALM. Un guadagno di risoluzione si osserva quando viene applicato PALM, che è supportato dai corrispondenti grafici di intensità. In particolare, le strutture sarcomere acquisite utilizzando un tampone di bassa qualità sembrano essere più spesse rispetto alle strutture catturate in condizioni di imaging ottimali.Questa mancanza di accuratezza dei dati è dovuta alle ridotte proprietà lampeggianti del fluoroforo, con conseguente riduzione dei fotoni rilevati per evento di localizzazione. Inoltre, la precisione di localizzazione viene ridotta, abbassando la risoluzione complessiva dell'immagine PALM ricostruita. Inoltre, la deriva del campione può influenzare la localizzazione precisa delle molecole fluorescenti con conseguente immagini sfocate.Per acquisire immagini PALM adeguate, è molto importante consentire l'equilibrazione termica dell'intero sistema di imaging per evitare un'eccessiva deriva del campione durante l'imaging. Seguendo questa procedura, altre strutture cellulari come i mitocondri possono essere immaginite dal PALM per acquisire parametri aggiuntivi di maturazione dei cardiomiociti.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

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