Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Denne studien ble støttet av EUs strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). I tillegg støttes H.L. av FORUN-programmet ved Rostock University Medical Centre (889001 og 889003) og Josef og Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. støttes av Clinician Scientist Program ved Rostock University Medical Center. R.D støttes av DFG (DA1296/6-1), DAMP foundation, German Heart Foundation (F/01/12) og BMBF (VIP+ 00240).
Vi takker Madeleine Bartsch for hennes tekniske støtte i iPSC cellekultur og hjertediensiasjon.

Alle trinnene i denne protokollen som involverer neonatale og voksne mus ble utført i henhold til de etiske retningslinjene for dyrepleie av Rostock University Medical Centre.
1. Dyrking og dissosiasjon av iPSC-avledede kardiomyocytter
<ol><li>Differensier hiPSC-CMs i 25 dager ved hjelp av en 2D-monolayer-metode som beskrevet tidligere17.</li>
	<li>Prewarm dissosiasjon medium til 37 °C og støtte middels til romtemperatur.</li>
	<li>Vask celler to ganger med PBS.</l...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

Genereringen av funksjonell iPSC-avledet CM in vitro er viktig for regenerative terapier, sykdomsmodellering og utvikling av legemiddelscreeningplattformer. Imidlertid er utilstrekkelig modenhet av disse CM et stort hinder i kardiovaskulær forskning20. I denne forbindelse er det nødvendig med høyoppløselige bildeteknikker som muliggjør overvåking av den strukturelle modningstilstanden til iPSC-avledet CM. Samtidig kan superoppløsning mikroskopi være et verdifullt verktøy for å nøyaktig ...

Kardiovaskulære sykdommer (CVD) som hjerteinfarkt eller kardiomyopati er fortsatt den viktigste dødsårsaken i den vestlige verden1. Som det menneskelige hjerte har bare dårlig regenerativ kapasitet, det er behov for strategier for å fremme utvinning fra CVDer. Dette inkluderer celleerstatningsterapi for å fylle opp tapte kardiomyocytter (CM), samt utvikling av nye antiarytmiske legemidler for effektiv og sikker farmasøytisk inngrep. Indusert pluripotente stamcelle (iPSC) har vist seg å være en lovende cellekilde for ubegrenset generasjon av human CM in vitro, egnet for regenerative terapier, sykdomsmodellering og for utvikling av legemiddelscreeninganalyser2,3,4.
Selv om mange forskjellige hjertediensiasjonsprotokoller finnes, mangler iPSC-avledet CM fortsatt visse fenotypiske og funksjonelle aspekter som emmer in vitro- og invivo-applikasjonen 5,,6. Ved siden av elektrofysiologiske, metabolske og molekylære endringer innebærer hjertemodningsprosessen den strukturelle organiseringen av sarkomer, som er de grunnleggende enhetene som kreves for kraftgenerering og cellesammentrekning7. Mens voksne CMs viser et godt organisert kontraktilt apparat, viser iPSC-avledede CMs ofte uarrangerte sarcomere-filamenter, forbundet med redusert sammentrekningsevne og endret sammentrekningsdynamikk8,,9. I motsetning til modne CM som viser enaksial sammentrekningsmønster, resulterer de desorienterte strukturene i umodne CM i en radial sammentrekning av hele cellen eller fremmer utseendet på sammentrekningsfokus9,10.
For å forbedre hjertemodning har flere tilnærminger blitt brukt, inkludert 3D-cellekulturmetoder, elektrisk og mekanisk stimulering, samt bruk av ekstracellulære matriser som etterligner in vivoforhold11,,12,,13. For å evaluere suksessen og effektiviteten til disse ulike kulturforholdene, er det nødvendig med teknikker for å overvåke og estimere graden av den strukturelle modningen av iPSC CM, for eksempel ved mikroskopiske teknikker. I motsetning til konvensjonell konfokal avbildning er oppløsningen ved fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) omtrent 10x høyere. Denne teknikken gir i sin tur en mer nøyaktig analyse, oppdage selv subtile endringer av cellulære strukturer14. Tatt i bruk den høye oppløsningen av PALM-basert bildebehandling, var det overordnede målet med denne metoden den mikroskopiske evalueringen av sarcomere modenhet i iPSC-avledede CMer ved presis bestemmelse av z-Disc tykkelse og sarcomere lengde. I tidligere studier har disse strukturelle egenskapene vist seg å være passende parametere for å vurdere hjertemodenhet15. For eksempel, syk iPSC-CM mangler full lengde dystrophin viser redusert sarcomere lengde og z-band bredde sammenlignet med vill type celler16. På samme måte ble lengden på individuelle sarkomer målt for å undersøke virkningen av topografiske signaler på hjerteutvikling16. Derfor brukte vi denne tilnærmingen til å evaluere den strukturelle modningen av sarcomere-nettverket i iPSC-CM ved kvantitativt måling av sarcomere lengde og z-platetykkelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

Modningen av iPSC-avledede kardiomyocytter er et kritisk problem for deres anvendelse i regenerativ terapi, narkotikatesting og sykdomsmodellering. Til tross for utviklingen av flere differensieringsprotokoller, er generasjonen av iPSC kardiomyocytter som ligner en voksenlignende fenotype fortsatt utfordrende. Et viktig aspekt ved kardiomyocytter modning innebærer dannelsen av et godt organisert sarcomere-nettverk for å sikre høy sammentrekningskapasitet. Her presenterer vi en super oppløsningsbasert tilnærming for semi-kvantitativ analyse av α-actinin-nettverket i kardiomyocytter. Ved hjelp av fotoaktivert lokalisering mikroskopi en sammenligning av sarcomere lengde og z-plate tykkelse av iPSC-avledet kardiomyocytter og hjerteceller isolert fra neonatal vev ble utført. Samtidig viser vi viktigheten av riktige bildeforhold for å oppnå pålitelige data. Våre resultater viser at denne metoden er egnet til å kvantitativt overvåke den strukturelle modenheten til hjerteceller med høy romlig oppløsning, slik at påvisning av selv subtile endringer i sarcomere-organisasjonen.

For å estimere graden av strukturell modning av CM ble neonatal, fullt moden voksen og iPSC CM opprinnelig merket CM med α-actinin antistoff for å visualisere sarkomerenettverket. Etter PALM-oppkjøpet ble bildene rekonstruert, og z-platetykkelsen ble målt ved hjelp av plugin-basert bildebehandlingsprogramvare for automatisk deteksjon av bredden på individuelle filamenter. Sarcomere lengde ble beregnet ved å måle avstanden mellom to tilstøtende intensitet topper, tilsvarende nærliggende filamenter. <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Dannelsen av et skikkelig sarcomere-nettverk er viktig for modning av iPSC-avledede kardiomyocytter. Vi presenterer en super oppløsningsbasert tilnærming som muliggjør kvantitativ evaluering av den strukturelle modningen av stamcelleavledede kardiomyocytter, for å forbedre kulturforhold som fremmer hjerteutvikling.

Analysere det α-Actinin-nettverket i humane iPSC-avledede kardiomyocytter ved hjelp av enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Denne metoden kan brukes til kvantitativ evaluering av sarcomere modning i iPSC-avledede kardiomyocytter. Ved hjelp av denne superoppløsningsbaserte tilnærmingen er det mulig å oppdage selv subtile endringer i sarcomere-organisasjonen, som ikke er mulig med konvensjonell konfokal avbildning. Minst tre timer før bruk, slå på mikroskopet og ta prøven til romtemperatur.Når mikroskopet er klart, legger du til 300 mikroliter med PALM-bildebuffer til en brønn med merkede celler og setter kammeret glidd inn i faseholderen av mikroskopet. Velg 1,57 NA 100X-oljemålet, og bruk PALM-modus i bildeprogramvaren og aktiver TIRF-innstillingene. Sett antall rammer til 5, 000 til 10, 000, UV lasereffekten til 0,1%og 647 laseren til 0,2%og forsterkninger nivået til 50 til 100.Når alle anskaffelsesparametrene er angitt, slår du på laserbelysningen og velger en målcelle. For å skaffe et bilde, øk 647 laserkraften til 100%og reduser gevinsten til null. Bleke målcellen i omtrent fem sekunder, øk deretter gevinsten til 50 og initier PALM-bildeoppkjøpet.For rekonstruksjon av PALM-dataene, på slutten av oppkjøpet, åpne dataene i ImageJ og åpne Tordenvær plugin. Velg kjør analyse i plugin-modulen, og åpne kameraoppsettmenyen. Angi pikselstørrelsen og den elektromagnetiske forsterkning.I kjøreanalysemenyen setter du B-spline-rekkefølgen til tre, B-spline-skalaen til to, terskelen for toppintensitet til stfwave. f1, monteringsradiusen til tre, den første sigma til 1,6, forstørrelsen til fem, oppdateringsfrekvensen til 50, og sideal skifter til to, og klikker OK. Etter rekonstruksjon velger du sigma i tegnemenyen histogrammet og bruker rektangelverktøyet til å velge et interesseområde, unntatt mulige artefakter. Legg til interesseområdet i filteret og legg til og usikkerhet mindre enn 25 i interesseområdet.I kategorien Fjern duplikater angir du en avstandsterskel på 10 nanometer. I sammenslåingsfanen setter du maksimal avstand til 20, de maksimale rammene per molekyl til null, og de maksimale avrammene til en. I kategorien driftkorrigering velger du krysskorrelasjon og angir antall hyller og forstørrelsen til fem, lagrer deretter det endelige PALM-bildet og eksporterer dataene etter prosessen.For å analysere sarkomerlengden, importerer du det rekonstruerte PALM-bildet av interesse til ImageJ og bruker linjeverktøyet til å tegne en linje mellom de valgte sarkomerestrukturene vinkelrett på Z-platen for å måle den korteste avstanden mellom actin-filamentene. Velg plottprofilen i analysemenyen og hent lengden mellom de to toppene. For å analysere Z-platetykkelsen, konverter det rekonstruerte PALM-bildet til et åtte-biters modusbilde og åpne Ridge Detection-plugin-modulen.Sett linjebredden til 20, den høye kontrasten til 230, den lave kontrasten til 10, sigma til 0,79, den nedre terskelen til 25,84 og minimum linjelengde til 20. Velg estimatbredde, utvid linje og vis resultater, klikk deretter OK, og bruk gjennomsnittslinjebredden fra resultattabellen for videre analyse. iPSC-avledede kardiomyocytter og neonatale celler viser et lignende alfa-aktininmønster med uregelmessige uarrangerte sarkomerstrukturer.Kvantitativ vurdering viser at lengden og tykkelsen på alfa actinin filamenter er nesten identiske mellom de to gruppene av celler som indikerer en for tidlig utviklingstilstand av iPSC-avledede kardiomyocytter. I motsetning viser voksne modne kardiomyocytter et vanlig sarcomere-nettverk med en litt økt sarkomerlengde og redusert Z-platetykkelse. En sammenligning av konvensjonell confocal imaging og PALM avslører ingen signifikant forskjell i sarcomere lengde.Imidlertid oppdages en dyp redusert Z-platetykkelse når iPSC kardiomyocytter blir utsatt for PALM-avbildning. En økning i oppløsning observeres når PALM brukes, noe som støttes av de tilsvarende intensitetsplottene. Spesielt ser sarcomere strukturer ervervet ved hjelp av en lav kvalitet buffer ser ut til å være tykkere sammenlignet med strukturer fanget under optimale bildeforhold.Denne mangelen på datanøyaktighet skyldes de reduserte blinkende egenskapene til fluoroforen, noe som resulterer i færre oppdagede fotoner per lokaliseringshendelse. Videre reduseres lokaliseringspresisjonen, noe som reduserer den totale oppløsningen til det rekonstruerte PALM-bildet. I tillegg kan prøvedrift påvirke den nøyaktige lokaliseringen av de fluorescerende molekylene som resulterer i uklare bilder.For å skaffe riktige PALM-bilder, er det svært viktig å tillate termisk likevekt av hele bildesystemet for å unngå overdreven prøvedrift under bildebehandling. Etter denne prosedyren kan andre cellulære strukturer som mitokondrier avbildes av PALM for å skaffe seg flere parametere for kardiomyocyttmodning.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkelt Cell transcriptional Profilering av Adult Mouse cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Lokalisering Bruke Photo-aktivert Lokalisering Mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Enkelt-molekyl Imaging of Gene Regulation<em&gt; In vivo</em&gt; Ved hjelp av Cotranslational Aktivering av Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analysere Kraniofacial Morphogenesis i sebrafisk ved hjelp av 4D konfokalmikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studerer DNA Looping av Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...