Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Denna studie stöddes av EU:s strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). Dessutom stöds H.L. av FORUN-programmet för Rostock University Medical Centre (889001 och 889003) samt Josef och Käthe Klinz Stiftelse (T319/29737/2017). C.I.L. stöds av Clinician Scientist Program vid Rostock University Medical Center. R.D stöds av DFG (DA1296/6-1), DAMP-stiftelsen, Tyska Hjärtstiftelsen (F/01/12) och BMBF (VIP+ 00240).
Vi tackar Madeleine Bartsch för hennes tekniska stöd i iPSC cell kultur och hjärt differentiering.

Alla steg i detta protokoll som involverar neonatal och vuxna möss utfördes enligt de etiska riktlinjerna för djurvård av Rostock University Medical Centre.
1. Odling och dissociation av iPSC-härledda kardiomyocyter
<ol><li>Differentiera hiPSC-CMs för 25 dagar med en 2D monolayer metod som beskrivs tidigare17.</li>
	<li>Prewarm dissociation medium till 37 °C och stöd medelhög till rumstemperatur.</li>
	<li>Tvätta celler två gånger med PBS.</li>
	<li>Tills?...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

Genereringen av funktionella iPSC-härledda CM in vitro är viktigt för regenerativa terapier, sjukdomsmodellering och utveckling av läkemedels-screening plattformar. Men otillräcklig mognad av dessa CM är ett stort hinder i kardiovaskulärforskning 20. I detta avseende behövs högupplösta avbildningstekniker som möjliggör övervakning av det strukturella mognadstillståndet för iPSC-härledda CM. Samtidigt kan super upplösning mikroskopi vara ett värdefullt verktyg för att exakt analy...

Hjärt-kärlsjukdomar (CVD) såsom hjärtinfarkt eller kardiomyopati förblir den främsta dödsorsaken i västvärlden1. Eftersom det mänskliga hjärtat bara besitter dålig regenerativ kapacitet, finns det ett behov av strategier för att främja återhämtningen från cvds. Detta inkluderar cell ersättningsterapier för att fylla förlorade kardiomyocyter (CM), samt utveckling av nya anti-arytmiska läkemedel för effektiv och säker farmaceutisk intervention. Inducerad pluripotent stamceller (iPSC) har visat sig vara en lovande cellkälla för obegränsad generation av mänskliga CM in vitro, lämplig för regenerativa terapier, sjukdom modellering, och för utveckling av läkemedelsscreening analyser2,3,4.
Även om många olika protokoll för hjärtdifferentiering finns saknar iPSC-härledda CM fortfarande vissa fenotypiska och funktionella aspekter som hindrar in vitro- och in vivo-tillämpningen5,6. Bredvid elektrophysiologic, metaboliska, och molekylära förändringar, hjärtmognad processen innebär den strukturella organisationen av sarkomerer, som är de grundläggande enheter som krävs för kraft generation och cell kontraktion7. Medan vuxna CMs uppvisar en välorganiserad kontraktil apparat, iPSC-härledda CMs visar ofta disarranged sarcomere glödtrådar, i samband med en minskad kontraktion förmåga och förändrad kontraktiondynamik 8,9. I motsats till mogna CM som visar uniaxial kontraktion mönster, de desorienterade strukturer i omogna CM resulterar i en radiell sammandragning av hela cellen eller främja uppkomsten av kontraktion kontaktpunkter9,10.
För att förbättra hjärtmognad har flera tillvägagångssätt tillämpats, inklusive 3D-cellodlingsmetoder, elektrisk och mekanisk stimulering, samt användning av extracellulära matriser som härmar i vivo-förhållanden11,12,13. För att utvärdera framgång och effektivitet av dessa olika odlingsförhållanden behövs tekniker för att övervaka och uppskatta graden av den strukturella mognaden av iPSC CM, t.ex. I motsats till konventionella confocal imaging, upplösningen vid fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) är ungefär 10x högre. Denna teknik i sin tur möjliggör en mer exakt analys, upptäcka även subtila förändringar av cellulära strukturer14. Med tanke på den höga upplösningen av PALM-baserade bildåtergivning, det övergripande målet för denna metod var den mikroskopiska utvärderingen av sarcomere mognad i iPSC-härledda CMs genom exakt bestämning av z-Disc tjocklek och sarcomere längd. I tidigare studier har dessa strukturella funktioner visat sig vara lämpliga parametrar för att bedöma hjärtmognad15. Till exempel, sjuka iPSC-CM saknar full längd dystrofin uppvisar minskad sarkomere längd och z-band bredd när man jämför med vilda typ celler16. Likaså var längden på enskilda sarkomeres mätt för att undersöka effekterna av topografiska ledtrådar på hjärtutveckling16. Därav tillämpade vi detta tillvägagångssätt för att utvärdera den strukturella mognaden av sarkomere nätverket i iPSC-CM genom att kvantitativt mäta sarkomlängd och z-skiva tjocklek.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

Mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter är en kritisk fråga för deras tillämpning i regenerativ terapi, drogtester och sjukdom modellering. Trots utvecklingen av flera differentiering protokoll, är generationen av iPSC kardiomyocyter som liknar en vuxen-liknande fenotyp fortfarande utmanande. En viktig aspekt av kardiomyocyter mognad innebär bildandet av en välorganiserad sarkomere nätverk för att säkerställa hög kontraktion kapacitet. Här presenterar vi en super resolution-baserad strategi för semi-kvantitativ analys av α-aktinin nätverk i kardiomyocyter. Använda photoactivated lokalisering mikroskopi en jämförelse av sarcomere längd och z-skiva tjocklek av iPSC-härledda kardiomyocyter och hjärt celler isolerade från neonatal vävnad utfördes. Samtidigt visar vi vikten av korrekt bildframställning villkor för att få tillförlitliga uppgifter. Våra resultat visar att denna metod är lämplig att kvantitativt övervaka den strukturella mognad hjärtceller med hög rumslig upplösning, möjliggör detektering av även subtila förändringar av sarkomere organisation.

För uppskattning av graden av strukturell mognad av CM, neonatal, fullt mogen vuxen och iPSC CM var ursprungligen märkt CM med α-aktinin antikropp för att visualisera sarcomere nätverket. Efter PALM förvärv, var bilder rekonstrueras, och z-skiva tjocklek mättes med hjälp av plugin-baserade bildbehandling programvara för automatisk upptäckt av bredden av enskilda glödtrådar. Sarcomere längd beräknades genom att mäta avståndet mellan två intilliggande intensitet toppar, motsvarande angränsande glödtråd...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Bildandet av en ordentlig sarkomer nätverk är viktigt för mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter. Vi presenterar en super resolution-baserade strategi som möjliggör kvantitativ utvärdering av den strukturella mognaden av stamceller härledda kardiomyocyter, att förbättra kultur villkor främja hjärt utveckling.

Analysera α-Actinin Network i mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter med hjälp av single molecule lokaliseringsmikroskopi

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Denna metod kan användas för den kvantitativa utvärderingen av sarkomeremognad i iPSC-härledda kardiomyocyter. Med hjälp av denna super upplösning-baserade tillvägagångssätt, är det möjligt att upptäcka även subtila förändringar i sarkomere organisation, vilket inte är möjligt med konventionella confocal imaging. Minst tre timmar före användning, slå på mikroskopet och föra provet till rumstemperatur.När mikroskopet är klart, tillsätt 300 mikroliter av PALM imaging buffert till en brunn av märkta celler och sätt kammaren glida in i scenen innehavaren av mikroskopet. Välj oljemålet 1,57 NA 100X och använd PALM-läget i bildhanteringsprogrammet och aktivera TIRF-inställningarna. Ställ in antalet bildrutor till 5, 000 till 10, 000, UV-lasereffekten till 0,1 %och 647-lasern till 0,2 % och förstärkningsnivån till 50 till 100.När alla anskaffningsparametrar har ställts in, slå på laserbelysningen och välj en målcell. För att skaffa en bild, öka 647 lasereffekten till 100%och minska vinsten till noll. Bleka målcellen i cirka fem sekunder, öka sedan förstärkningen till 50 och initiera PALM-bildförvärvet.För rekonstruktion av PALM-data, i slutet av förvärvet, öppna data i ImageJ och öppna Thunderstorm plugin. Välj kör analys i plugin och öppna kamerans inställningsmenyn. Ange pixelstorlek och den elektromagnetiska förstärkningen.I kör analysmenyn, ställ in B-spline ordning till tre, B-spline skala till två, topp intensitet tröskeln till stfwave. f1, den passande radien till tre, den initiala sigma till 1.6, förstoringen till fem, uppdateringen frekvensen till 50, och de laterala skiftar till två, och klicka PÅ OK. Efter rekonstruktion väljer du Sigma i menyn för plotthistogram och använder rektangelverktyget för att välja en region av intresse, exklusive möjliga artefakter. Lägg till den region av intresse till filtret och lägg till och osäkerhet mindre än 25 till regionen av intressevärden.Ange en avståndströskel på 10 nanometer i fliken ta bort dubbletter. I den sammangående fliken ställer du in maxavståndet till 20, de maximala bildrutorna per molekyl till noll och de maximala avramarna till en. I fliken avdriftskorrigering väljer du korskorrelation och anger antalet lagerplatser och förstoringen till fem, och sparar sedan den slutliga PALM-bilden och exporterar efterprocessens data.För att analysera sarkomerlängden, importera den rekonstruerade PALM bilden av intresse i ImageJ och använda linjeverktyget för att dra en linje mellan de valda sarkomerstrukturerna vinkelrätt mot Z-skivan för att mäta det kortaste avståndet mellan aktinfilamenten. I analysmenyn väljer du plotprofil och anskaffar längden mellan de två topparna. Om du vill analysera Z-skivans tjocklek konverterar du den rekonstruerade PALM-bilden till en bild med åtta bitars läge och öppnar insticksprogrammet För Ridge Detection.Ställ in linjebredden på 20, den höga kontrasten till 230, den låga kontrasten till 10, sigma till 0,79, den nedre tröskeln till 25,84 och den minsta linjelängden till 20. Välj uppskattningsbredd, utöka linje och visningsresultat, klicka sedan på OK och använd medellinjebredden från resultattabellen för vidare analys. iPSC-härledda kardiomyocyte och neonatal celler uppvisar en liknande alfa aktinin mönster med oregelbundna disarranged sarcomere strukturer.Kvantitativ bedömning visar att längden och tjockleken av alfa aktinin glödtrådar är nästan identiska mellan de två grupperna av celler som anger en tidig utvecklingstillstånd iPSC-härledda kardiomyocyter. Däremot vuxen mogna kardiomyocyter uppvisar en regelbunden sarkomere nätverk med en något ökad sarcomere längd och minskad Z-skiva tjocklek. En jämförelse av konventionella confocal bildframställning och PALM avslöjar ingen signifikant skillnad i sarcomere längd.Men, en djupgående minskad Z-skiva tjocklek upptäcks när iPSC kardiomyocyter utsätts för PALM imaging. En vinst i upplösning observeras när PALM appliceras, vilket stöds av motsvarande intensitet tomter. Särskilt, sarkomer strukturer som förvärvats med hjälp av en låg kvalitet buffert verkar vara tjockare jämfört med strukturer fångas under optimala bildframställning villkor.Denna brist på datanoggrannhet beror på fluoroforeens minskade blinkande egenskaper, vilket resulterar i färre upptäckta fotoner per lokaliseringshändelse. Dessutom är lokalisering precision minskade, sänka den övergripande upplösningen av den rekonstruerade PALM bilden. Dessutom kan provdrift påverka den exakta lokaliseringen av de fluorescerande molekylerna vilket resulterar i suddiga bilder.För att skaffa ordentlig PALM bilder, är det mycket viktigt att tillåta termisk jämvikt av hela bildsystemet för att undvika överdriven provdrift under bildbehandling. Efter detta förfarande, andra cellulära strukturer såsom mitokondrier kan avbildas av PALM att förvärva ytterligare parametrar av kardiomyocyte mognad.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualisering Singel molekylkomplex In Vivo Använda avancerade fluorescensmikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Enda molekyl avbildning av kärntransport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualisering av interstitiella celler i Cajal (ICC) Network i Möss

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: proteinlokalisering Använda Photo-aktiverad lokalisering Mikroskopi och elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Enda molekyl avbildning av genreglering<em&gt; In vivo</em&gt; Använda Cotranslational Aktivering genom klyvning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analysera Kraniofaciala Morphogenesis i Zebrafish Använda 4D konfokalmikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studera DNA Looping med enda molekyl FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...