Name: analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Bu çalışma AB Yapısal Fonu (ESF/14-BM-A55-0024/18) tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, H.L. Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi FORUN Programı (889001 ve 889003) ve Josef ve Käthe Klinz Vakfı (T319/29737/2017) tarafından desteklenir. C.I.L. Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi'nin Klinisyen Bilim Adamı Programı tarafından desteklenir. R.D DFG (DA1296/6-1), DAMP vakfı, Alman Kalp Vakfı (F/01/12) ve BMBF (VIP+ 00240) tarafından desteklenir.
Madeleine Bartsch'a iPSC hücre kültürü ve kardiyak farklılaşmadaki teknik desteği için teşekkür ederiz.

Yenidoğan ve erişkin fareleri içeren bu protokoldeki tüm adımlar Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi'nin hayvan bakımına yönelik etik kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin yetiştirilmesi ve ayrıştırılması
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi 2D monolayer yöntemi kullanarak 25 gün boyunca hiPSC-CMs ayırt17.</li>
	<li>37 °C'ye kadar önceden ısınan dissosyon orta ve oda sıcaklığına orta destek.</...

<ol>
	<li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012:+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data.">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling:+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us.">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331 (2019).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients.">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).</li><li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment.">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).</li><li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells:+Current+strategies+and+limitations.">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li><li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues.">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li><li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture.">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li><li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adolescence:+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li><li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes.">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients.">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment.">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness.">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li><li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy:+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images.">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells.">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li><li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy.">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes.">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li><li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function.">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li><li>Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+for+cell+biologists.">Super-resolution imaging for cell biologists.</a> BioEssays. , (2015).</li><li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols.">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).</li><li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research.">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li><li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li><li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy.">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy.">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).</li><li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy.">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li><li>Olivier, N., Keller, D., G&#246;nczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers.">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins.">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Erd&#233;lyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy.">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li><li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy.">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li></ol>

Fonksiyonel iPSC türetilmiş CM in vitro üretimi rejeneratif tedaviler, hastalık modelleme ve ilaç tarama platformlarının geliştirilmesi için önemlidir. Ancak, bu CM yetersiz olgunluk kardiyovasküler araştırma önemli bir engeldir20. Bu bağlamda, iPSC kaynaklı CM'nin yapısal olgunlaşma durumunun izlenmesini sağlayacak yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerine ihtiyaç vardır. Aynı zamanda, süper çözünürlüklü mikroskopi tam olarak belirli proteinlerin işlevin...

Miyokard enfarktüsü veya kardiyomiyopati gibi kardiyovasküler hastalıklar (KVD) batı dünyasında önemli ölüm nedeni olmaya devam etmektedir1. İnsan kalbi sadece kötü rejeneratif kapasiteye sahip olduğundan, CVD'lerden iyileşmeyi teşvik etmek için stratejilere ihtiyaç vardır. Bu kayıp kardiyomiyositler doldurmak için hücre replasman tedavileri içerir (CM), yanı sıra verimli ve güvenli farmasötik müdahale için yeni anti-aritmik ilaçların geliştirilmesi. Indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) insan CM in vitro sınırsız nesil için umut verici bir hücre kaynağı olduğu gösterilmiştir, rejeneratif tedaviler için uygun, hastalık modelleme, ve ilaç tarama tahlilleri gelişimi için2,3,4.
Birçok farklı kardiyak farklılaşma protokolleri mevcut olmasına rağmen, iPSC kaynaklı CM hala in vitro ve in vivo uygulama5,,6engel bazı fenotipik ve fonksiyonel yönleri eksikliği . Elektrofizyolojik, metabolik ve moleküler değişikliklerin yanı sıra, kardiyak olgunlaşma süreci sarcomeres yapısal organizasyon içerir, hangi kuvvet üretimi ve hücre daralması için gerekli temel birimleri olan7. Yetişkin CM'ler iyi organize edilmiş bir kontraktil cihaz sergilerken, iPSC kaynaklı CM'ler genellikle azaltılmış kasılma yeteneği ve değiştirilmiş daralma dinamikleri ile ilişkili, düzensiz sarcomere filamentler göstermek8,9. Tek eksenli kasılma deseni gösteren olgun CM aksine, olgunlaşmamış CM içinde şaşırmış yapılar tüm hücrenin radyal daralma sonuçları veya daralma odak noktaları nın görünümünü teşvik9,10.
Kardiyak olgunlaşmageliştirmek için, birden fazla yaklaşımlar uygulanmıştır, 3D hücre kültürü yöntemleri de dahil olmak üzere, elektrik ve mekanik stimülasyon, yanı sıra vivo koşullarda taklit hücre dışı matriskullanımı11,12,13. Bu farklı kültür koşullarının başarısını ve verimliliğini değerlendirmek için, iPSC CM'nin yapısal olgunlaşma derecesini mikroskobik teknikler ile izlemek ve tahmin etmek için tekniklere ihtiyaç vardır. Konvansiyonel konfokal görüntülemenin aksine fotoaktik lokalizasyon mikroskobu (PALM) durumunda çözünürlük yaklaşık 10 kat daha yüksektir. Sırayla bu teknik daha doğru bir analiz sağlar, hücresel yapıların bile ince değişiklikler tespit14. PALM tabanlı görüntülemenin yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, bu yöntemin genel amacı, iPSC kaynaklı CM'lerde z-Disk kalınlığı ve sarcomere uzunluğunun kesin olarak belirlenmesi ile sarcomere olgunluğunun mikroskobik değerlendirilmesidir. Daha önceki çalışmalarda, bu yapısal özellikleri kardiyak olgunluk değerlendirmek için uygun parametreler olduğu gösterilmiştir15. Örneğin, hastalıklı iPSC-CM tam uzunlukta distrofin sergileyen vahşi tip hücrelere göre sarcomere uzunluğu ve z-bant genişliği azaltılmış16. Aynı şekilde, bireysel sarcomeres uzunluğu kardiyak gelişim16üzerinde topografik ipuçları etkisini araştırmak için ölçüldü. Bu nedenle bu yaklaşımı, sarcomere uzunluğu ve z-disk kalınlığını nicel olarak ölçerek iPSC-CM'deki sarcomere ağının yapısal olgunlaşmasını değerlendirmek için uyguladık.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>human iPSC cell line</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y00325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte Dissociation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>138924-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30070-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image processing software (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187150100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyranose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4234-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sarcomeric &#945;-actinin antibody [EA-53]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the &alpha;-actinin network in human ipsc-derived cardiomyocytes using single molecule localization microscopy

iPSC türetilmiş kardiyomiyositlerin olgunlaşması rejeneratif tedavi, ilaç testi ve hastalık modelleme uygulamaları için kritik bir konudur. Birden fazla farklılaşma protokolünün geliştirilmesine rağmen, yetişkin benzeri fenotipi andıran iPSC kardiyomiyositlerin üretimi zorlu olmaya devam etmektedir. Kardiyomiyosit olgunlaşmasının önemli bir yönü, yüksek daralma kapasitesini sağlamak için iyi organize edilmiş bir sarcomere ağının oluşmasını içerir. Burada kardiyomiyositlerde α-aktinin ağının yarı kantitatif analizi için süper çözünürlük tabanlı bir yaklaşım salıyoruz. Fotoaktil lokalizasyon mikroskopisi kullanılarak iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin ve yenidoğan dokusundan izole edilen kardiyak hücrelerin sarkokan uzunluğu ve z-disk kalınlığı karşılaştırması yapıldı. Aynı zamanda, güvenilir veri elde etmek için uygun görüntüleme koşullarının önemini de gösteriyoruz. Sonuçlarımız, bu yöntemin yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip kardiyak hücrelerin yapısal olgunluğunu kantitatif olarak izlemek için uygun olduğunu ve sarcomere organizasyonunun ince değişikliklerinin bile saptanmasını sağladığını göstermektedir.

CM yapısal olgunlaşma derecesini tahmin etmek için, neonatal, tamamen olgun yetişkin, ve iPSC CM başlangıçta sarcomere ağ görselleştirmek için α-aktinin antikor ile CM etiketli edildi. PALM'ın satın alınmasının ardından görüntüler yeniden oluşturuldu ve z-disk kalınlığı, tek tek filamentlerin genişliğinin otomatik olarak algılanması için eklenti tabanlı görüntü işleme yazılımı kullanılarak ölçüldü. Sarcomere uzunluğu komşu filamentlere karşılık gelen iki komşu yoğunluk z...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the ÃŽÂ±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy at JoVE.com

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.

Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Bu yöntem, iPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde sarcomere olgunlaşmasının nicel değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu süper çözünürlük tabanlı yaklaşımı kullanarak, geleneksel konfokal görüntüleme ile mümkün değildir sarcomere organizasyon, hatta ince değişiklikler tespit etmek mümkündür. Kullanımdan en az üç saat önce mikroskobu açın ve numuneyi oda sıcaklığına getirin.Mikroskop hazır olduğunda, etiketli hücrelerin bir kuyuya 300 mikrolitre PALM görüntüleme tamponekleyin ve mikroskopun sahne tutucusu içine oda slayt ekleyin. 1.57 NA 100X yağ hedefini seçin ve görüntüleme yazılımında PALM modunu kullanın ve TIRF ayarlarını etkinleştirin. Çerçeve sayısını 5,000 ila 10,000'e, UV lazer gücünü %0,1'e ve 647 lazeri %0,2'ye ve kazanç seviyesini 50-100'e ayarlayın.Tüm edinme parametreleri ayarlandığında, lazer aydınlatmasını açın ve bir hedef hücre seçin. Bir görüntü elde etmek için, 647 lazer gücünü %100'e yükseltin ve kazancı sıfıra indirin. Hedef hücreyi yaklaşık beş saniye boyunca ağartın, sonra kazancı 50'ye yükseltin ve PALM görüntü edinimi başlatın.PALM verilerinin yeniden inşası için, satın alma sonunda, ImageJ'deki verileri açın ve Thunderstorm eklentisini açın. Eklentide çalıştır analizini seçin ve kamera kurulum menüsünü açın. Piksel boyutunu ve elektromanyetik kazancı girin.Çalıştırma analizi menüsünde, B-spline sırasını üçe, B-spline ölçeğini ikiye, stfwave'e en yüksek yoğunluk eşiğini ayarlayın. f1, üç e sığma yarıçapı, ilk sigma 1.6, beş büyütme, 50 güncelleme frekansı ve yanal iki vardiya ve Tamam'ı tıklatın. Yeniden yapılandırmadan sonra, çizim histogram menüsünde sigma seçin ve olası eserler hariç ilgi bir bölge seçmek için dikdörtgen aracını kullanın. Filtreye ilgi bölgesini ekleyin ve ilgi değerleri bölgesine 25'ten az belirsizlik ekleyin.Yinelenenleri kaldırma sekmesinde, 10 nanometrelik bir mesafe eşiği girin. Birleştirme sekmesinde, maksimum mesafeyi 20'ye, molekül başına maksimum kareyi sıfıra, en yüksek kapalı kareleri bire ayarlayın. Drift düzeltme sekmesinde, çapraz korelasyon seçin ve kutular ve büyütme sayısını beş olarak ayarlayın, sonra son PALM görüntü kaydedin ve işlem sonrası verileri dışa aktarın.Sarcomere uzunluğunu analiz etmek için, yeniden oluşturulmuş PALM görüntüsünü ImageJ'e aktarın ve aktin filamentleri arasındaki en kısa mesafeyi ölçmek için seçilen sarcomere yapıları arasında Z-diske dik bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Çözümleme menüsünde, çizim profilini seçin ve iki tepe arasındaki uzunluğu elde edin. Z-disk kalınlığını analiz etmek için yeniden oluşturulmuş PALM görüntüsünü sekiz bitlik mod görüntüsüne dönüştürün ve Sırt Algılama eklentisini açın.Çizgi genişliğini 20'ye, yüksek kontrastı 230'a, düşük kontrastı 10'a, sigmayı 0,79'a, alt eşiği 25,84'e ve minimum çizgi uzunluğunu 20'ye ayarlayın. Tahmin genişliğini seçin, satırı genişletin ve sonuçları görüntüleyin, ardından Tamam'ı tıklatın ve daha fazla çözümleme için sonuçlar tablosundaki ortalama çizgi genişliğini kullanın. iPSC türetilmiş kardiyomiyosit ve neonatal hücreler düzensiz düzensiz sarcomere yapıları ile benzer bir alfa aktin deseni sergilerler.Kantitatif değerlendirme, alfa aktin in filamentlerinin uzunluğu ve kalınlığının, iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin erken gelişim durumunu gösteren iki hücre grubu arasında hemen hemen aynı olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, erişkin olgun kardiyomiyositler biraz artmış sarcomere uzunluğu ve azaltılmış Z-disk kalınlığı ile düzenli bir sarcomere ağ sergilerler. Konvansiyonel konfokal görüntüleme ve PALM bir karşılaştırma sarcomere uzunluğu önemli bir fark ortaya koymaktadır.Ancak, iPSC kardiyomiyositler PALM görüntülemeye tabi tutulduğunda derin bir azaltılmış Z-disk kalınlığı saptanır. PALM uygulandığında, ilgili yoğunluk çizimleri tarafından desteklenen bir çözünürlük artışı gözlenir. Özellikle düşük kaliteli bir tampon kullanılarak elde edilen sarcomere yapıları, optimum görüntüleme koşullarında yakalanan yapılara göre daha kalın görüner.Bu veri doğruluğu eksikliği floroforun yanıp sönme özelliklerinin azalmasından kaynaklanır ve bu da yerelleştirme olayı başına daha az algılanan fotonla sonuçlanır. Ayrıca, yerelleştirme hassasiyeti azaltılır ve yeniden inşa edilen PALM görüntüsünün genel çözünürlüğü azalır. Buna ek olarak, örnek kayması bulanık görüntülerle sonuçlanan floresan moleküllerin kesin lokalizasyonunu etkileyebilir.Uygun PALM görüntüleri elde etmek için, görüntüleme sırasında aşırı örnek kayması önlemek için tüm görüntüleme sisteminin termal equilibration izin vermek çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, mitokondri gibi diğer hücresel yapılar palm tarafından kardiyomiyosit olgunlaşma ek parametreleri elde etmek için görüntülenebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...