Name: murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis
Uploaded: 2020-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis at JoVE.com

We zijn alle leden van het Dunnwald Lab dankbaar die in de loop der jaren hebben bijgedragen aan de optimalisatie van dit protocol, en aan Gina Schatteman wiens volharding in het bevorderen van het gebruik van seriële secties voor wondanalyse de oprichting ervan mogelijk heeft gemaakt. Dit werk werd ondersteund door financiering van NIH/NIAMS aan Martine Dunnwald (AR067739).

Alle experimenten werden voltooid in overeenstemming met de federale regelgeving en de Universiteit van Iowa beleid en procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Iowa IACUC.
1. Dieren en veeteelt
<ol><li>Gebruik volwassen muizen van de gewenste muislijn op 8-10 weken oud wanneer het haarzakje stadium is in telogen.</li>
	<li>Op de dag van de operatie, scheiden muizen in schone kooien en individueel huis om wondverstoring te minimaliseren.</li>
</ol>2. Chirurgi...

<ol>
	<li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration:+mechanisms,+signaling,+and+translation.">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modeling+Conundrum:+Murine+Models+for+Cutaneous+Wound+Healing.">A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+immunodeficient+TGF-beta+1+knockout+mice.">Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice.</a> Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).</li><li>Pietramaggiori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cutaneous+healing+in+diabetic+mice+exposed+to+healthy+peripheral+circulation.">Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+in+PBS.">Paraformaldehyde in PBS.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).</li><li>Gerharz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+murine+skin+wound+healing:+standardization+of+experimental+procedures+and+impact+of+an+advanced+multitissue+array+technique.">Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique.</a> Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).</li><li>Le, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+3+is+required+for+proper+excisional+wound+repair+in+vivo.">Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo.</a> PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).</li><li>Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+mediated+by+activation+of+Toll-like+receptor+9.">Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9.</a> Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Shaw, T. J., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+a+showcase+for+cell+plasticity+and+migration.">Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).</li><li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intensity+laser+therapy+speeds+wound+healing+in+hemophilia+by+enhancing+platelet+procoagulant+activity.">Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity.</a> Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Uchiyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+Epidermal+Overexpression+Promotes+Cutaneous+Wound+Healing+via+Activation+of+EGFR/MEK/ERK+Signaling+Mediated+by+EGFR+Ligands.">SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Rhea, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+6+is+required+for+proper+wound+healing+in+vivo.">Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo.</a> Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).</li></ol>

Het bilaterale excisional wondmodel is een zeer aanpasbare procedure die kan worden gebruikt om veel verschillende aspecten van wondgenezing te bestuderen. Voordat ze met een wondhelend project beginnen, moeten onderzoekers een energieanalyse uitvoeren om het aantal wonden te bepalen dat nodig is om een defect van een bepaalde effectgrootte op te sporen. Inconsistenties bestaan in de literatuur over de vraag of individuele muizen of wonden moeten worden gebruikt als biologische replica's, echter, een recente studie toond...

Cutane wondgenezing is een complex biologisch proces met sequentieel overlappende fasen. Het vereist de coördinatie van cellulaire en moleculaire processen die tijdelijk en ruimtelijk worden gereguleerd om de barrièrefunctie van het beschadigde epitheel te herstellen. In de eerste fase migreren ontstekingen, neutrofielen en macrofagen naar de wond en mobiliseren lokale en systemische afweer1. Het volgen en overlappen van de ontstekingsfase is de proliferatiefase. Fibroblasten beginnen zich snel te vermenigvuldigen en migreren naar het granulatieweefsel. Keratinocyten uit de buurt van de voorste rand directioneel vermenigvuldigen naar de wond als gedifferentieerde keratinocyten in de voorste rand migreren naar re-epithialize de wond2. Ten slotte begint de remodellerings- en rijpingsfase, waarbij fibroblasten in het granulatieweefsel collageen beginnen te synthetiseren en deponeren. De verbouwing en organisatie van de nieuwe matrix kan tot 1 jaar duren na letsel3. Vanwege de complexiteit van overlappende gebeurtenissen waarbij cross-talk tussen meerdere celtypen, en ondanks jaren van onderzoek, veel van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan wondgenezing blijven slecht begrepen.
Het muismodel is het overheersende zoogdiermodel voor het onderzoeken van mechanismen van wondgenezing vanwege hun gebruiksgemak, relatief lage kosten en genetische manipulabiliteit1,4,5. Hoewel verschillende soorten wonden zijn beschreven in het murine model, de meest voorkomende is een excisional wond (ofwel bilaterale punch of directe punch biopsie), gevolgd door incisional wound modellen4. De excisional wond model heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van de incisie model als het inherent genereert controleweefsel dat niet heeft ondergaan het genezingsproces. De punch biopsie weefsel dat wordt verwijderd als onderdeel van het chirurgische protocol kan worden verwerkt op dezelfde manier als het gewonde weefsel en gebruikt om de homeostatische omstandigheden vast te stellen voor een gewenst criterium. Uitgesneden controleweefsel kan ook nuttig zijn bij het beoordelen van de effecten van een voorbehandeling van de huid of het bevestigen van een succesvolle genwijziging op het moment van letsel4.
Helende parameters kunnen worden beoordeeld door veel verschillende technieken, waaronder planimetrie of histologie. Planimetrie kan echter alleen de zichtbare kenmerken van de wond evalueren, en vanwege de aanwezigheid van een korst, correleert vaak niet met metingen van genezing die worden gevisualiseerd door histologie, waardoor histologie de "gouden standaard" van analyse4wordt. Ondanks histologische analyse is de gouden standaard, het wordt meestal uitgevoerd op een willekeurige subset van de wond6,7. Bijvoorbeeld, het snijden van de wond in "helft" voorafgaand aan het inbedden en doorsnijden van de wond is momenteel gebruikelijk om de tijd en middelen die worden besteed aan het doorsnijden van materialen en gegevensanalyse te verminderen. De in dit protocol beschreven methode van morfometrische analyse werd ontwikkeld om het volledige wondweefsel te omvatten, om de morfologische kenmerken van de wond nauwkeurig weer te geven en de kans op het detecteren van wondgenezingsdefecten met een kleine effectgrootte te vergroten. In dit protocol beschrijven we een chirurgische methode voor het genereren van de meest bestudeerde murinewond, de bilaterale excisionale wond met volledige dikte, evenals een gedetailleerde en rigoureuze methode voor histologische analyse die zelden in het veld wordt gebruikt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep</td>
			<td>NOVAPLUS</td>
			<td>V9100</td>
			<td>70% Isopropyl alcohol, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pads</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>22-222-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plastic sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>With digital acquisition capabilities and a 4X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 x 60 #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax sheets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include a ruler for scale, if applicable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection teasing needle (straight)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 x 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding rings</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>M460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Conair</td>
			<td></td>
			<td>Moist dry Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Type 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassette</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>M490-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>ASR</td>
			<td></td>
			<td>.009 Regular Duty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punches</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Size as determined by researcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide boxes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide warmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrosted microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22 037 246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding station</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minimum of a oven with a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic opthalmic ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers, curved tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers, tapered tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WypAll X60</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34865</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis

Het murine excisional wondmodel is op grote schaal gebruikt om elk van de sequentiële overlappende fasen van wondgenezing te bestuderen: ontsteking, proliferatie en remodellering. Murine wonden hebben een histologisch goed gedefinieerde en gemakkelijk herkenbare wondbed waarover deze verschillende fasen van het genezingsproces meetbaar zijn. Binnen het veld is het gebruikelijk om een willekeurig gedefinieerd "midden" van de wond te gebruiken voor histologische analyses. Wonden zijn echter een driedimensionale entiteit en vaak niet histologisch symmetrisch, wat de noodzaak van een goed gedefinieerde en robuuste kwantificeringsmethode ondersteunt om morfometrische defecten met een kleine effectgrootte te detecteren. In dit protocol beschrijven we de procedure voor het maken van bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen, evenals een gedetailleerde instructie over het meten van morfometrische parameters met behulp van een beeldverwerkingsprogramma op geselecteerde seriële secties. De metingen met twee dimensies van wondlengte, opperhuidlengte, opperhuidgebied en wondgebied worden gebruikt in combinatie met de bekende afstand tussen secties om het epidermale gebied met drie dimensies dat de wond, het totale wondgebied, het oppervolume en het wondvolume bedekt, te extrapoleren. Hoewel deze gedetailleerde histologische analyse meer tijd en middelen verbruikt dan conventionele analyses, verhoogt de strengheid de kans op het detecteren van nieuwe fenotypes in een inherent complex wondgenezingsproces.

Figuur 5 toont het bereik in gemeten en berekende waarden verkregen door het uitvoeren van morfometrische analyse op wilde wonden gegenereerd in verschillende muizenstammen door meerdere chirurgen en geanalyseerd door verschillende individuen. Wild-type muizen van verschillende stammen kunnen statistische verschillen vertonen zoals beschreven in zowel onze studies als in de literatuur9,10. Op basis van deze representatieve resultaten...

Watch this Scientific Journal Video about Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis at JoVE.com

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

Dit protocol beschrijft hoe bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen kunnen worden gegenereerd en hoe u de wonden vervolgens controleren, oogsten en voorbereiden op morfometrische analyse. Inbegrepen is een diepgaande beschrijving van het gebruik van seriële histologische secties om morfometrische defecten te definiëren, nauwkeurig te kwantificeren en op te sporen.

Murine Excisional Wound Healing Model en Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Dit protocol maakt gebruik van histologische analyse om robuuste morfometrische metingen van muizenexcisional wonden te verkrijgen. Met behulp van deze techniek kunnen we de hele wond analyseren met behulp van een subset van seriële secties, waardoor we defecten die anders zouden kunnen worden gemist nauwkeuriger kunnen detecteren. Het aantonen van de procedure zal Lindsey Rhea zijn, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex bij een verdoofde volwassen muis, breng zalf aan op de ogen van het dier en gebruik een elektrische scheermesklipper in een caudal-rostral beweging om de vacht op de achterkant van de muis op schouderniveau te verwijderen. Gebruik een scheermesje gehouden op een hoek van 20 graden van de rug in een rostral-caudal beweging om alle resterende haren te verwijderen uit de blootgestelde huid, dan reinigen van de huid met een povidon jodium en een 70% isopropyl alcohol prep pad veeg. Voor wondinductie, draperen een schone papieren handdoek op een vlakke ondergrond bedekt met tandwas en plaats de muis op de handdoek in de liggende positie.Knijp de huid van de muis tussen de schouderbladen langs de rug middellijn en trek de ingeklemde huid vouw uit de buurt van het lichaam. Schakel de muis in een zijwaarts liggende positie, plaats een biopsie punch van de gewenste wondgrootte zo dicht mogelijk bij het lichaam en laat de huid om te ontspannen. Druk op de punch met behulp van een schommelende beweging om alle lagen van de huid te doorboren en verwijder de punch biopsieën uit de wond met behulp van steriele schaar en pincet om de punch te bevrijden van de omliggende huid als dat nodig is.Laat de muis vervolgens herstellen met monitoring en analgesie. Open voor morfometrische analyse van het wondbed een digitaal gekleurd wondbeeld. Als u de schaal- en meetvoorkeuren wilt instellen, selecteert u onder Schaal analyseren de optie Schaal instellen en voert u de afstand in pixels, de bekende afstand en de lengte-eenheid in.Selecteer Globaal en OK om de schaal voor elke geopende afbeelding gelijk te houden en selecteer Analyseren en Metingen instellen om te bevestigen dat het gebiedvak is ingeschakeld. Om de wondlengte te meten, selecteert u uit de vrije hand en gebruikt u het gereedschap om langs de huid-epidermale verbinding te traceren, vanaf de laatste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de ene kant van de wond tot de eerste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de andere kant. Als de opperhuid niet de gehele wond bedekt, volg dan de huid-epidermale verbinding aan de ene kant van de wond waar de migrerende tong eindigt en ga door met het superieure aspect van het granulatieweefsel of de kruising tussen het granulatieweefsel en de korst totdat de migrerende tong en de eerste haarzakje van het niet gewonde weefsel aan de andere kant van de wond zijn bereikt.Klik vervolgens op Analyseren en meten. De lengte van de meting wordt weergegeven in dezelfde eenheden als in de schaal. Als de opperhuid niet de gehele wond bedekt, meet dan de afstand tussen elke epidermale voorrand volgens het superieure aspect van het granulatieweefsel of de kruising tussen het granulatieweefsel en de korst tot de eerste haarzakje.Om het wondgebied te meten, gebruikt u het gereedschap uit de vrije hand om het superieure aspect van de opperhuid of het superieure aspect van het granulatieweefsel te traceren vanaf de laatste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de ene kant van de wond tot de eerste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de andere kant. Blijf verticaal langs de haarzakje in het granulatieweefsel traceren. Zodra de tegenovergestelde haarzakje en vetweefsel of spier zijn bereikt, volg de inferieure rand van de granulatie weefsel aan de andere kant van de wond en sluit het startpunt langs het haarzakje om het gebied te sluiten.Als de wond niet volledig epitheel is, traceer dan het superieure aspect van de opperhuid tot aan de voorrand en keer terug naar het beginpunt na de huid-epidermale kruising. Zoals geïllustreerd, bij het nemen van 2D-metingen gedurende de gehele wond, waren we in staat om parameters te berekenen die niet mogelijk zijn met 2D-analyse op het midden van de wond alleen, wat een veelgebruikte methode in het veld is. In dit experiment werden 2D-metingen van het wondgebied gebruikt en gemiddeld over de gehele wond of een middelste subset van de wond en bleek geen significant verschil tussen experimentele groepen of de analysemethoden.Het berekende wondvolume verschilde echter aanzienlijk tussen de experimentele groepen, wat het belang aantoonde van een diepgaande histologische analyse van wondgenezingsparameters. Het genereren van consequent formaat wonden voor histologische analyse en het uitvoeren van rigoureuze seriële secties zijn van cruciaal belang voor een nauwkeurige morfometrische analyse. Onbevlekte secties kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentie of Masson's trichrome kleuring om andere aspecten van wondgenezing te meten, terwijl flitsvroestende wonden kunnen worden gebruikt naast morfometrie voor kwantitatieve eiwitanalyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebravis Keratocyte Explantaten naar Collective Cel Migratie en reepithelialization in Cutane Wound Healing Bestudeer

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Oprichting van een klinisch relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultuur van muizen embryonale Middenvoetsbeentjes: Een Fysiologische Model van endochondrale Verbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

Een inrichting voor het uitvoeren van celmigratie / wondgenezing in een 96-putjesplaat

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...