Name: murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis
Uploaded: 2020-08-21T15:00:00
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Wir danken allen Mitgliedern des Dunnwald Lab, die im Laufe der Jahre zur Optimierung dieses Protokolls beigetragen haben, und Gina Schatteman, deren Beharrlichkeit bei der Förderung des Einsatzes von seriellen Sektionen für die Wundanalyse seine Entstehung ermöglichte. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel von NIH/NIAMS an Martine Dunnwald (AR067739) unterstützt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Bundesbestimmungen und der Politik der University of Iowa und Verfahren abgeschlossen und wurden von der University of Iowa IACUC genehmigt.
1. Tiere und Haltung
<ol><li>Verwenden Sie erwachsene Mäuse der gewünschten Mauslinie im Alter von 8-10 Wochen, wenn das Haarfollikelstadium in Telogen ist.</li>
	<li>Trennen Sie am Tag der Operation Mäuse in saubere Käfige und einzeln, um Wundstörungen zu minimieren.</li>
</ol><p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration:+mechanisms,+signaling,+and+translation.">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modeling+Conundrum:+Murine+Models+for+Cutaneous+Wound+Healing.">A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+immunodeficient+TGF-beta+1+knockout+mice.">Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice.</a> Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).</li><li>Pietramaggiori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cutaneous+healing+in+diabetic+mice+exposed+to+healthy+peripheral+circulation.">Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+in+PBS.">Paraformaldehyde in PBS.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).</li><li>Gerharz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+murine+skin+wound+healing:+standardization+of+experimental+procedures+and+impact+of+an+advanced+multitissue+array+technique.">Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique.</a> Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).</li><li>Le, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+3+is+required+for+proper+excisional+wound+repair+in+vivo.">Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo.</a> PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).</li><li>Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+mediated+by+activation+of+Toll-like+receptor+9.">Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9.</a> Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Shaw, T. J., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+a+showcase+for+cell+plasticity+and+migration.">Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).</li><li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intensity+laser+therapy+speeds+wound+healing+in+hemophilia+by+enhancing+platelet+procoagulant+activity.">Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity.</a> Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Uchiyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+Epidermal+Overexpression+Promotes+Cutaneous+Wound+Healing+via+Activation+of+EGFR/MEK/ERK+Signaling+Mediated+by+EGFR+Ligands.">SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Rhea, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+6+is+required+for+proper+wound+healing+in+vivo.">Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo.</a> Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).</li></ol>

Das bilaterale Exzisions-Wundmodell ist ein hochgradig anpassbares Verfahren, das verwendet werden kann, um viele verschiedene Aspekte der Wundheilung zu studieren. Bevor die Ermittler ein Wundheilungsprojekt beginnen, sollten sie eine Leistungsanalyse durchführen, um die Anzahl der Wunden zu ermitteln, die erforderlich sind, um einen Defekt einer bestimmten Effektgröße zu erkennen. In der Literatur gibt es Ungereimtheiten darüber, ob einzelne Mäuse oder Wunden als biologische Repliken verwendet werden sollten, jedo...

Die Hautwundheilung ist ein komplexer biologischer Prozess mit sequenziell überlappenden Phasen. Es erfordert die Koordination zellulärer und molekularer Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert werden, um die Barrierefunktion des beschädigten Epithels wiederherzustellen. In der ersten Phase wandern Entzündungen, Neutrophile und Makrophagen in die Wunde und mobilisieren lokale und systemische Abwehrkräfte1. Nach und überlappend ist die Entzündliche Phase das Proliferationsstadium. Fibroblasten beginnen sich schnell auszumehren und in das Granulationsgewebe zu wandern. Keratinozyten weg von der Vorderkante, die sich richtungsweisend zur Wunde ausbreiten, während differenzierte Keratinozyten in der Vorderkante wandern, um die Wunde2wieder zu epithelisieren. Schließlich beginnt die Umbau- und Reifungsphase, in der Fibroblasten im Granulationsgewebe zu synthetisieren und Kollagen ablagern. Der Umbau und die Organisation der neuen Matrix kann bis zu 1 Jahr nach Verletzungdauern 3. Aufgrund der Komplexität überlappender Ereignisse mit Cross-Talk zwischen mehreren Zelltypen und trotz jahrelanger Forschung bleiben viele der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Wundheilung zugrunde liegen, schlecht verstanden.
Das Mausmodell ist das vorherrschende Säugetiermodell zur Untersuchung von Mechanismen der Wundheilung aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, relativ niedrigen Kosten und genetischen Manipulierbarkeit1,4,5. Obwohl verschiedene Arten von Wunden im murinen Modell beschrieben wurden, ist die häufigste eine exzistive Wunde (entweder bilateraler Schlag oder direkte Schlagbiopsie), gefolgt von Inzisionswundmodellen4. Das exzisionale Wundmodell hat einen deutlichen Vorteil gegenüber dem Inzisionsmodell, da es von Natur aus Kontrollgewebe erzeugt, das den Heilungsprozess nicht durchlaufen hat. Das im Rahmen des Operationsprotokolls ausgeschnittene Schlagbiopsiegewebe kann auf die gleiche Weise wie das verwundete Gewebe verarbeitet und zur Ermittlung der otostatischen Bedingungen für ein gewünschtes Kriterium verwendet werden. Verbrauchgesteuertes Kontrollgewebe kann auch nützlich sein, wenn die Auswirkungen einer Hautvorbehandlung beurteilt oder eine erfolgreiche Genveränderung zum Zeitpunkt der Verletzung bestätigt wird4.
Heilparameter können mit vielen verschiedenen Techniken bewertet werden, einschließlich Planimetrie oder Histologie. Die Planimetrie kann jedoch nur sichtbare Eigenschaften der Wunde bewerten und korreliert aufgrund des Vorhandenseins eines Schorfes oft nicht mit Messungen der Heilung, die durch histologische Visualisierung visualisiert werden, wodurch die Histologie zum "Goldstandard" der Analyse4wird. Obwohl die histologische Analyse der Goldstandard ist, wird sie am häufigsten auf einer beliebigen Teilmenge der Wunde6,7durchgeführt. Zum Beispiel ist das Schneiden der Wunde in "halb" vor dem Einbetten und Schneiden der Wunde derzeit gängige Praxis, um den Zeit- und Ressourcenaufwand für das Schneiden von Materialien und die Datenanalyse zu reduzieren. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode der morphometrischen Analyse wurde entwickelt, um das gesamte Wundgewebe zu umfassen, die morphologischen Eigenschaften der Wunde genau widerzuspiegeln und die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, Wundheilungsdefekte mit einer geringen Effektgröße zu erkennen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine chirurgische Methode zur Erzeugung der am häufigsten untersuchten murinen Wunde, der bilateralen Volldicke excisionalwunde, sowie eine detaillierte und strenge Methode für die histologische Analyse, die selten auf dem Feld verwendet wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep</td>
			<td>NOVAPLUS</td>
			<td>V9100</td>
			<td>70% Isopropyl alcohol, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pads</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>22-222-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plastic sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>With digital acquisition capabilities and a 4X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 x 60 #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax sheets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include a ruler for scale, if applicable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection teasing needle (straight)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 x 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding rings</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>M460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Conair</td>
			<td></td>
			<td>Moist dry Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Type 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassette</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>M490-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>ASR</td>
			<td></td>
			<td>.009 Regular Duty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punches</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Size as determined by researcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide boxes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide warmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrosted microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22 037 246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding station</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minimum of a oven with a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic opthalmic ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers, curved tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers, tapered tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WypAll X60</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34865</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis

Das murine excisionale Wundmodell wurde ausgiebig verwendet, um jede der sequenziell überlappenden Phasen der Wundheilung zu untersuchen: Entzündung, Proliferation und Umbau. Murine Wunden haben ein histologisch gut definiertes und leicht erkennbares Wundbett, über das diese verschiedenen Phasen des Heilungsprozesses messbar sind. Innerhalb des Feldes ist es üblich, eine willkürlich definierte "Mitte" der Wunde für histologische Analysen zu verwenden. Wunden sind jedoch ein dreidimensionales Gebilde und oft nicht histologisch symmetrisch, was die Notwendigkeit einer klar definierten und robusten Methode der Quantifizierung zur Erkennung morphometrischer Defekte mit geringer Effektgröße unterstützt. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zum Erstellen bilateraler, volldickender Exzisionswunden bei Mäusen sowie eine detaillierte Anleitung zur Messung morphometrischer Parameter mithilfe eines Bildverarbeitungsprogramms auf ausgewählten seriellen Abschnitten. Die zweidimensionigen Messungen von Wundlänge, epidermaler Länge, epidermaler Fläche und Wundfläche werden in Kombination mit dem bekannten Abstand zwischen abschnittsweise verwendet, um den dreidimensionigen epidermalen Bereich zu extrapolieren, der die Wunde, die gesamte Wundfläche, das epidermale Volumen und das Wundvolumen abdeckt. Obwohl diese detaillierte histologische Analyse zeitaufwändiger ist als herkömmliche Analysen, erhöht ihre Strenge die Wahrscheinlichkeit, neuartige Phänotypen in einem inhärent komplexen Wundheilungsprozess zu erkennen.

Abbildung 5 zeigt den Bereich der gemessenen und berechneten Werte, die durch morphometrische Analysen an Wildtypwunden erzielt wurden, die in verschiedenen Mausstämmen von mehreren Chirurgen erzeugt und von verschiedenen Individuen analysiert wurden. Wildtyp-Mäuse aus verschiedenen Stämmen können statistische Unterschiede aufweisen, wie sie sowohl in unseren Studien als auch in der Literatur9,10beschrieben werden. Basierend auf ...

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Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

Dieses Protokoll beschreibt, wie bilaterale, volldicke Exzisionswunden bei Mäusen erzeugt werden und wie man anschließend die Wunden für die morphometrische Analyse überwacht, erntet und vorbereitet. Enthalten ist eine ausführliche Beschreibung der Verwendung von seriellen histologischen Abschnitten zur Definition, präzisen Quantifizierung und Erkennung morphometrischer Defekte.

Murine Excisional Wound Healing Model und histologische morphometrische Wundanalyse

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Dieses Protokoll verwendet histologische Analysen, um robuste morphometrische Messungen von Mausexzisionalwunden zu erhalten. Mit dieser Technik können wir die gesamte Wunde mit einer Teilmenge von seriellen Abschnitten analysieren, so dass wir Fehler genauer erkennen können, die andernfalls übersehen werden könnten. Demonstriert wird das Verfahren von Lindsey Rhea, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor.Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Pedalreflex in einer anästhesierten erwachsenen Maus, tragen Salbe auf die Augen des Tieres und verwenden Sie einen elektrischen Rasiermesser Clipper in einer kaudal-rostralen Bewegung, um das Fell auf der Rückseite der Maus auf der Schulterebene zu entfernen. Verwenden Sie eine Rasierklinge in einem 20-Grad-Winkel von hinten in einer rostral-kaudalen Bewegung gehalten, um alle verbleibenden Haare von der exponierten Haut zu entfernen, dann reinigen Sie die Haut mit einem Povidon Jod und einem 70%isopropyl Alkohol Prep Pad Wischen. Für die Wundinduktion ein sauberes Handtuch auf Papierbasis auf eine flache, mit Zahnwachs bedeckte Oberfläche drapieren und die Maus in der anfälligen Position auf das Handtuch positionieren.Kneifen Sie die Haut der Maus zwischen den Schulterblättern entlang der dorsalen Mittellinie und ziehen Sie die eingeklemmte Hautfalte vom Körper weg. Die Maus in eine seitlich liegende Position schalten, einen Biopsie-Punch der gewünschten Wundgröße so nah wie möglich am Körper platzieren und die Haut entspannen lassen. Drücken Sie den Stempel mit einer Schaukelbewegung, um alle Hautschichten zu durchstechen und entfernen Sie die Schlagbiopsien mit steriler Schere und Pinzette aus der Wunde, um den Schlag bei Bedarf von der umgebenden Haut zu befreien.Dann lassen Sie die Maus mit Überwachung und Analgesie erholen. Für die morphometrische Analyse des Wundbettes öffnen Sie ein digital esbiertes Wundbild. Um die Skalierungs- und Messeinstellungen festzulegen, wählen Sie unter Analysieren die Option Skalierung festlegen aus, und geben Sie den Abstand in Pixel, die bekannte Entfernung und die Längeneinheit ein.Wählen Sie Global und OK aus, um die Skalierung für jedes geöffnete Bild gleich zu halten, und wählen Sie Analysieren und Festlegen von Messungen aus, um zu bestätigen, dass das Bereichsfeld aktiviert ist. Um die Wundlänge zu messen, wählen Sie Freihand, und verwenden Sie das Werkzeug, um entlang der dermal-epidermalen Kreuzung zu verfolgen, beginnend mit dem letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite. Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde bedeckt, folgen Sie der dermal-epidermalen Kreuzung auf einer Seite der Wunde, wo die wandernde Zunge endet, und folgen Sie weiterhin dem übergeordneten Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf, bis die wandernde Zunge und der erste Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite der Wunde erreicht sind.Klicken Sie dann auf Analysieren und Messen. Die Länge der Messung wird in den gleichen Einheiten angezeigt, die in der Skala festgelegt sind. Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde bedeckt, messen Sie den Abstand zwischen jeder epidermalen Vorderkante nach dem übergeordneten Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf zum ersten Haarfollikel.Um den Wundbereich zu messen, verwenden Sie das Freihandwerkzeug, um entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis oder des überlegenen Aspekts des Granulationsgewebes vom letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite zu verfolgen. Fahren Sie fort, vertikal entlang der Haarfollikel in das Granulationsgewebe zu verfolgen. Sobald der gegenüberliegende Haarfollikel und Fettgewebe oder Muskel erreicht sind, folgen Sie der unteren Grenze des Granulationsgewebes auf der gegenüberliegenden Seite der Wunde und verbinden Sie den Ausgangspunkt entlang des Haarfollikels, um den Bereich zu schließen.Wenn die Wunde nicht vollständig epithelialisiert ist, verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis bis zur Vorderkante und kehren Sie zum Ausgangspunkt nach der dermal-epidermalen Kreuzung zurück. Wie dargestellt, konnten wir bei 2D-Messungen in der gesamten Wunde Parameter berechnen, die mit einer 2D-Analyse nur in der Mitte der Wunde nicht möglich waren, was eine häufig verwendete Methode im Feld ist. In diesem Experiment wurden 2D-Messungen der Wundfläche verwendet und über die gesamte Wunde oder eine mittlere Teilmenge der Wunde gemittelt und ergaben keinen signifikanten Unterschied zwischen experimentellen Gruppen oder den Analysemethoden.Das berechnete Wundvolumen war jedoch zwischen den versuchsreichen Gruppen signifikant unterschiedlich, was die Bedeutung einer tiefgehenden histologischen Analyse der Wundheilungsparameter demonstrierte. Das Generieren von wunden konstant großer Größe für die histologische Analyse und die Durchführung strenger serieller Schnitte sind für eine genaue morphometrische Analyse von entscheidender Bedeutung. Ungefärbte Abschnitte können für Die Immunfluoreszenz oder Massons trichrome Färbung verwendet werden, um andere Aspekte der Wundheilung zu messen, während flashgefrorene Wunden neben der Morphometrie für die quantitative Proteinanalyse verwendet werden können.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

Eine Vorrichtung zur Durchführung Zellmigration / Wundheilung in einer 96-Well-Platte

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Co-Lokalisierung zwischen Komponenten von Gap, Tight und Adherens Junctions in Murine Mamma Drüsen

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...