Name: murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis
Uploaded: 2020-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis at JoVE.com

Siamo grati a tutti i membri del Dunnwald Lab che hanno contribuito all'ottimizzazione di questo protocollo nel corso degli anni, e a Gina Schatteman la cui persistenza nel promuovere l'uso del sezionale seriale per l'analisi delle ferite ne ha reso possibile la creazione. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti da NIH /NIAMS a Martine Dunnwald (AR067739).

Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità con le normative federali e la politica e le procedure dell'Università dell'Iowa sono state approvate dalla IACUC dell'Università dell'Iowa.
1. Animali e allevamento
<ol><li>Usa topi adulti della linea del mouse desiderata a 8-10 settimane di età quando lo stadio del follicolo pilifero è in telogen.</li>
	<li>Il giorno dell'intervento chirurgico, separare i topi in gabbie pulite e alloggiare individualmente per ridurre al minimo ...

<ol>
	<li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration:+mechanisms,+signaling,+and+translation.">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice.">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modeling+Conundrum:+Murine+Models+for+Cutaneous+Wound+Healing.">A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+immunodeficient+TGF-beta+1+knockout+mice.">Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice.</a> Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).</li><li>Pietramaggiori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cutaneous+healing+in+diabetic+mice+exposed+to+healthy+peripheral+circulation.">Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+in+PBS.">Paraformaldehyde in PBS.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).</li><li>Gerharz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+murine+skin+wound+healing:+standardization+of+experimental+procedures+and+impact+of+an+advanced+multitissue+array+technique.">Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique.</a> Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).</li><li>Le, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+3+is+required+for+proper+excisional+wound+repair+in+vivo.">Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo.</a> PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).</li><li>Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+mediated+by+activation+of+Toll-like+receptor+9.">Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9.</a> Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Shaw, T. J., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+a+showcase+for+cell+plasticity+and+migration.">Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).</li><li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intensity+laser+therapy+speeds+wound+healing+in+hemophilia+by+enhancing+platelet+procoagulant+activity.">Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity.</a> Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Uchiyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+Epidermal+Overexpression+Promotes+Cutaneous+Wound+Healing+via+Activation+of+EGFR/MEK/ERK+Signaling+Mediated+by+EGFR+Ligands.">SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Rhea, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+6+is+required+for+proper+wound+healing+in+vivo.">Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo.</a> Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).</li></ol>

Il modello bilaterale di ferita accisa è una procedura altamente personalizzabile che può essere utilizzata per studiare molti aspetti diversi della guarigione delle ferite. Prima di iniziare un progetto di guarigione delle ferite, gli investigatori devono eseguire un'analisi del potere per determinare il numero di ferite necessarie per rilevare un difetto di una particolare dimensione dell'effetto. Esistono incongruenze all'interno della letteratura sul fatto che singoli topi o ferite debbano essere usati come replich...

La guarigione cutanea delle ferite è un processo biologico complesso con fasi di sovrapposizione sequenziale. Richiede la coordinazione di processi cellulari e molecolari che sono regolati in modo temporale e spaziale al fine di ripristinare la funzione barriera dell'epitelio danneggiato. Nella prima fase, infiammazione, neutrofili e macrofagi migrano nella ferita, mobilitando difese locali e sistemiche1. Seguire e sovrapporre la fase infiammatoria è la fase di proliferazione. I fibroblasti iniziano rapidamente a prolifere e migrare nel tessuto di granulazione. I cheratinociti lontano dal bordo d'attacco proliferano direzionale verso la ferita mentre i cheratinociti differenziati nel bordo anteriore migrano per er epitelializzare laferita 2. Infine, inizia la fase di rimodellamento e maturazione, durante la quale i fibroblasti nel tessuto di granulazione iniziano a sintetizzare e depositare collagene. Il rimodellamento e l'organizzazione della nuova matrice possono durare fino a 1 anno dopo l'infortunio3. A causa della complessità degli eventi sovrapposti che coinvolgono il cross-talk tra più tipi di cellule, e nonostante anni di ricerca, molti dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della guarigione delle ferite rimangono poco compresi.
Il modello di topo è il modello di mammifero predominante per lo studio dei meccanismi di guarigione delle ferite a causa della loro facilità d'uso, costo relativamente basso e manipolabilità genetica1,4,5. Sebbene diversi tipi di ferite siano stati descritti nel modello murino, il più comune è una ferita adicisionale (pugno bilaterale o biopsia a pugno diretto), seguita da modelli di ferita incisiva4. Il modello di ferita adicizionale ha un netto vantaggio rispetto al modello incisivo in quanto genera intrinsecamente tessuto di controllo che non ha subito il processo di guarigione. Il tessuto di biopsia del punzone che viene asportato come parte del protocollo chirurgico può essere elaborato allo stesso modo del tessuto ferito e utilizzato per stabilire le condizioni omeostatiche per un criterio desiderato. Il tessuto di controllo delle accise può anche essere utile se si valutano gli effetti di un pretrattamento cutaneo o si conferma un'alterazione genica riuscita al momento dellalesione 4.
I parametri di guarigione possono essere valutati con molte tecniche diverse, tra cui planimetria o istologia. Tuttavia, la planimetria può solo valutare le caratteristiche visibili della ferita, e a causa della presenza di una crosta, spesso non è correlata a misurazioni di guarigione che vengono visualizzate dall'istologia, rendendo così l'istologia il "gold standard" dell'analisi4. Nonostante l'analisi istologica sia il gold standard, viene spesso eseguita su un sottoinsieme arbitrario della ferita6,7. Ad esempio, tagliare la ferita a "metà" prima di incorporare e sessare la ferita è attualmente una pratica comune per ridurre il tempo e le risorse spesi per sezionamento dei materiali e analisi dei dati. Il metodo di analisi morfometrica descritto in questo protocollo è stato sviluppato per comprendere l'intero tessuto della ferita, per riflettere accuratamente le caratteristiche morfologiche della ferita e per aumentare la probabilità di rilevare difetti di guarigione delle ferite con una piccola dimensione dell'effetto. In questo protocollo, dettagliamo un metodo chirurgico per generare la ferita murina più comunemente studiata, la ferita incisiva bilaterale a pieno spessore, nonché un metodo dettagliato e rigoroso per l'analisi istologica che viene usato raramente sul campo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep</td>
			<td>NOVAPLUS</td>
			<td>V9100</td>
			<td>70% Isopropyl alcohol, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy pads</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>22-222-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plastic sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>With digital acquisition capabilities and a 4X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 x 60 #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax sheets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Include a ruler for scale, if applicable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection teasing needle (straight)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 x 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding rings</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>M460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Conair</td>
			<td></td>
			<td>Moist dry Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Type 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassette</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>M490-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>ASR</td>
			<td></td>
			<td>.009 Regular Duty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punches</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Size as determined by researcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide boxes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide warmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrosted microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22 037 246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding station</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minimum of a oven with a vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic opthalmic ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers, curved tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers, tapered tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sterile for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WypAll X60</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34865</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis

Il modello di ferita escisionale murina è stato ampiamente utilizzato per studiare ciascuna delle fasi sequenzialmente sovrapposte della guarigione delle ferite: infiammazione, proliferazione e rimodellamento. Le ferite murine hanno un letto di ferita istologicamente ben definito e facilmente riconoscibile su cui sono misurabili queste diverse fasi del processo di guarigione. All'interno del campo, è comune usare un "mezzo" arbitrariamente definito della ferita per analisi istologiche. Tuttavia, le ferite sono un'entità tridimensionale e spesso non istologicamente simmetriche, supportando la necessità di un metodo di quantificazione ben definito e robusto per rilevare difetti morfometrici con una piccola dimensione dell'effetto. In questo protocollo, descriviamo la procedura per la creazione di ferite adicisionali bilaterali a pieno spessore nei topi, nonché un'istruzione dettagliata su come misurare i parametri morfometrici utilizzando un programma di elaborazione delle immagini su sezioni seriali selezionate. Le misurazioni a due dimensioni della lunghezza della ferita, della lunghezza epidermica, dell'area epidermica e dell'area della ferita sono utilizzate in combinazione con la distanza nota tra le sezioni per estrapolare l'area epidermica a tre dimensioni che copre la ferita, l'area complessiva della ferita, il volume epidermico e il volume della ferita. Sebbene questa dettagliata analisi istologica sia più dispendiosa in termini di tempo e risorse rispetto alle analisi convenzionali, il suo rigore aumenta la probabilità di rilevare nuovi fenotipi in un processo di guarigione delle ferite intrinsecamente complesso.

La figura 5 descrive l'intervallo in valori misurati e calcolati ottenuti eseguendo analisi morfometriche su ferite di tipo selvaggio generate in diversi ceppi di topi da più chirurghi e analizzate da diversi individui. Topi di tipo selvatico di diversi ceppi possono mostrare differenze statistiche come descritto sia nei nostri studi che nellaletteratura 9,10. Sulla base di questi risultati rappresentativi, raccomandiamo che, all'in...

Watch this Scientific Journal Video about Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis at JoVE.com

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

Questo protocollo descrive come generare ferite escisionali bilaterali a pieno spessore nei topi e come monitorare, raccogliere e preparare successivamente le ferite per l'analisi morfometrica. È inclusa una descrizione approfondita di come utilizzare sezioni istologiche seriali per definire, quantificare e rilevare con precisione i difetti morfometrici.

Modello di guarigione delle ferite escisionali murine e analisi istologica delle ferite morfometriche

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Questo protocollo utilizza l'analisi istologica per ottenere robuste misurazioni morfometriche delle ferite eccisionali del topo. Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare l'intera ferita utilizzando un sottoinsieme di sezioni seriali, permettendoci di rilevare in modo più accurato difetti che altrimenti potrebbero essere persi. A dimostrare la procedura sarà Lindsey Rhea, una ricerca associata del mio laboratorio.Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo adulto anestetizzato, applicare un unguento agli occhi dell'animale e utilizzare un clipper di rasoio elettrico in un movimento caudale-rostrale per rimuovere la pelliccia sul retro del mouse a livello della spalla. Utilizzare una lama di rasoio tenuta con un angolo di 20 gradi dalla parte posteriore in un movimento rostrale-caudale per rimuovere i capelli rimanenti dalla pelle esposta, quindi pulire la pelle con uno iodio di povidone e una salvietta per la preparazione dell'alcol isopropile al 70%. Per l'induzione della ferita, drappeggiare un asciugamano pulito a base di carta su una superficie piana coperta di cera dentale e posizionare il mouse sull'asciugamano in posizione prona.Pizzicare la pelle del mouse tra le scapole lungo la linea mediana dorsale e tirare la piega della pelle sandwich lontano dal corpo. Passando il mouse in una posizione laterale, posizionare un pugno di biopsia della dimensione della ferita desiderata il più vicino possibile al corpo e consentire alla pelle di rilassarsi. Premere verso il basso sul punzone usando un movimento a dondolo per forare tutti gli strati della pelle e rimuovere le biopsie del pugno dalla ferita usando forbici sterili e pinzette per liberare il pugno dalla pelle circostante se necessario.Quindi consentire al mouse di recuperare con monitoraggio e analgesia. Per l'analisi morfometrica del letto della ferita, aprire un'immagine digitale della ferita macchiata. Per impostare le preferenze di scala e misurazione, in Analizza selezionare Imposta scala e immettere la distanza in pixel, la distanza nota e l'unità di lunghezza.Selezionate Globale (Global) e OK per mantenere la scala uguale per ogni immagine aperta e selezionate Analizza (Analyze) e Imposta misure (Set Measurements) per confermare che la casella area è selezionata. Per misurare la lunghezza della ferita, selezionare a mano libera e utilizzare lo strumento per tracciare lungo la giunzione dermica-epidermica, a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altro lato. Se l'epidermide non copre l'intera ferita, seguire la giunzione dermica-epidermica su un lato della ferita dove termina la lingua migrata e continuare a seguire l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta fino a raggiungere la lingua migratare e il primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altra parte della ferita.Quindi fare clic su Analizza e misura. La lunghezza della misurazione apparirà nelle stesse unità impostate nella scala. Se l'epidermide non copre l'intera ferita, misurare la distanza tra ogni bordo d'attacco epidermico seguendo l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta al primo follicolo pilifero.Per misurare l'area della ferita, utilizzare lo strumento a mano libera per tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide o l'aspetto superiore del tessuto di granulazione a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altro lato. Continuare a tracciare verticalmente lungo il follicolo pilifero nel tessuto di granulazione. Una volta raggiunto il follicolo pilifero opposto e il tessuto o il muscolo adiposo, seguire il bordo inferiore del tessuto di granulazione sul lato opposto della ferita e unire il punto di partenza lungo il follicolo pilifero per chiudere l'area.Se la ferita non è completamente epiteliale, tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide fino al bordo anteriore e tornare al punto di partenza seguendo la giunzione dermico-epidermica. Come illustrato, quando si esrendono misurazioni 2D su tutta la ferita, siamo stati in grado di calcolare parametri non possibili con l'analisi 2D solo al centro della ferita, che è un metodo comunemente usato sul campo. In questo esperimento, sono state utilizzate e medie misurazioni 2D dell'area della ferita sull'intera ferita o su un sottoinsieme centrale della ferita e non hanno rivelato alcuna differenza significativa tra i gruppi sperimentali o i metodi di analisi.Il volume della ferita calcolato, tuttavia, era significativamente diverso tra i gruppi sperimentali, dimostrando l'importanza di un'analisi istologica approfondita dei parametri di guarigione delle ferite. Generare ferite di dimensioni costanti per l'analisi istologica ed eseguire rigorosi sessantazioni seriali è fondamentale per un'accurata analisi morfometrica. Le sezioni non macchiate possono essere utilizzate per l'immunofluorescenza o la colorazione tricroma di Masson per misurare altri aspetti della guarigione delle ferite, mentre le ferite congelate flash possono essere utilizzate insieme alla morfometria per l'analisi quantitativa delle proteine.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Istituzione di un clinicamente rilevanti<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Isolamento rapido di BMPR-IB + derivate da tessuto adiposo cellule stromali per l&#39;uso in un cranica difetto di guarigione Modello

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Analisi istologiche di lesioni al fegato acuto alcolico in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analisi delle interazioni proteine-proteine ​​e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...